1Мкк официальный сайт: Государственное казенное общеобразовательное учреждение города Москвы «Кадетская школа-интернат № 1 «Первый Московский кадетский корпус»

Содержание

Дистанционное обучение, ГКОУ КШИ № 1, Москва

Обращение к  кадетам

от директора Первого Московского кадетского корпуса

Кадеты!

           В течение этого периода у вас будет возможность проявить самостоятельность и упорство. Наши учителя будут помогать вам в этом: ежедневно в вашем электронном дневнике будут размещаться задания, которые необходимо выполнять к указанному сроку и направлять учителям на проверку, также вы можете смотреть увлекательные уроки с ведущими учителями Москвы на канале МосОбрТВ.

Я знаю, что такая задача вам по силам!

          Если у вас будут возникать вопросы, вы всегда можете задать их по электронной почте учителям, завучу или вашим воспитателям.             

Обо всех изменениях мы будем информировать вас через классных руководителей, воспитателей и с помощью размещения информации на официальном сайте Корпусе.

Обращаюсь к вам с просьбой, не посещать торговые центры, парки и другие общественные места.

Помните, что главное – это здоровье. Берегите себя!

         Директор генерал-майор Крымский В.Я.

×

Вы действительно хотите удалить папку?

Задать вопрос, ГКОУ КШИ № 1, Москва

08. 09.2021 Воронина Надежда Сергеевна  

вопрос №5717

Добрый день! Владимир Яковлевич! Я, Воронина Надежда Сергеевна, мама воспитанника Воронина Леонида. Обращаюсь к Вам с такой просьбой: Подскажите пожалуйста, что я могу сделать, чтобы сын был в классе (он первый год), в который попал изначально в 8 «Х» Навигацкой школе, там он уже подружился с детьми и ему очень понравилось, 01. 09. его перевели в класс, где дети уже обучаются не первый год 8»Р» и естественно у них отношение к нему другое, сын очень расстроен, никогда обычно не жалуется ни на что, но по поводу ребят и их поведения пожаловался… Я сама понимаю, что у Вас перебор с количеством учащихся, в каждом классе определенное количество ребят, но вдруг можно попробовать что-то сделать. Ранее он рассказывал взахлеб от радости с классом «Х», а теперь все по-другому. Как мать переживаю тоже, хочется чтобы там не выживал, а учил и проживал спокойно. Спасибо за понимание.


Задать вопрос, ГКОУ КШИ № 1, Москва

Я подтверждаю свое согласие:

  1. На использование в качестве каналов передачи информации, содержащейся в обращении, открытых каналов связи сети Интернет.
  2. На обработку моих персональных данных в соответствии с федеральным законом РФ от 27. 07.2006 № 152-ФЗ «О персональных данных».

В случае согласия с установленным порядком нажмите «Согласен» для продолжения работы. Если Вы не согласны, нажмите «Не согласен» для завершения работы.

Согласен  /  Не согласен

Всего вопросов: 1225

20.04.2021 Полякова Светлана Владимировна  

вопрос №5640

Здравствуйте. Подскажите пожалуйста, есть ли в Вашей школе классы для девочек с круглосуточным проживанием?


08.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5640

Здравствуйте, набор девочек  с круглосуточным пребыванием осуществляется в Кадетскую школу государственных воспитанниц с 8 класса.

20.04.2021 Оксана Сафонова Вячеславовна  

вопрос №5639

Здравствуйте, хотелось уточнить по поводу зачисления. Ребенку 15 лет заканчивает 8 класс . По обучению очень слабо тянет . Но физ подготовка хорошая , мальчик умный много лениться. Нам реально к вам попасть ?


25.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5639

Здравствуйте, зачисление в 9 класс возможно только на вакантное место в Навигацкую школу, которая располагается по адресу: ул. Кастанаевская д.59. (метро Кунцево). Вся информация по перечню документов, условиям приема и об ответственных лицах за прием документов  размещена на нашем официальном сайте в разделе «Условия приема» или «Как поступить в кадетский корпус». 

20.04.2021 Ларькина Ирина Викторовна  

вопрос №5638

Здравствуйте, меня зовут Ирина Викторовна. Хотела бы узнать есть ли у Вас места на должность учителя физической культуры. — Опыт работы 8 лет 8 месяцев; — Заведующая кафедрой физической культуры; — Высшая категория; — Организация и проведения ГТО , Олимпиады по физической культуры; — Организация праздников и мероприятий; — КМС по баскетболу; — Педагог дополнительного образования. Резюме прикрепляю ниже. Заранее спасибо.

25.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5638

Здравствуйте, выканции учителя физической культуры нет.

19.04.2021 Кузнецов Сергей Владимирович  

вопрос №5637

Добрый день. Подскажите, пожалуйста, есть ли в ОО вакансия «воспитатель кадетского класса» или преподаватель ОБЖ? Имеется соответствующее образование и стаж работы в кадетском корпусе г. Москва. Заранее благодарю.


25.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5637

  Здравствуйте, пришлите свое резюме  на адрес эл. почты [email protected]

16.04.2021 Светлана Александровна Митцева  

вопрос №5636

Здравствуйте. Проживаем в Саратовской области. Возможно ли для зачисления в 10 класс, подать документы пока без Московской прописки? По обстоятельствам прописка будет позже.


25.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5636

Здравствуйте, зачисление в 10-е  классы Корпуса  осуществляется в соответствии с «Положением о зачислении в 10-е профильные классы…», которое размещено на нашем официальном сайте в разделе Условия приема. На этой  же страничке сайта, есть подробная инструкция о подаче документов в 10-е классы.  

09.04.2021 Лариса  

вопрос №5635

Добрый день, правильно я увидела , что в 7 класса на следующий учебный год на круглосуточное пребывание набора не будет? И скажите пожалуйста ребенок прописан в Московской области, возможно ли поступление в вашу организацию?


25.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5635

Здравствуйте, зачисление в 7 класс осуществляется только на приходящий режим. Поступление возможно с регистрацией в Москве по месту пребывания  (временная). 

06.04.2021 Васильева Светлана Владимировна  

вопрос №5634

Добрый день! Подскажите пожалуйста, будут ли места в 4 классе в 2021-2022 учебном году? Планируем приехать 17 числа на день открытых дверей. Нужно ли предварительно записываться? Спасибо.


25.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5634

Здравствуйте, благодарим за выбор нашего образовательного учреждения. Зачисление в 4 класс на следующий год будет только на вакантные места.

06.04.2021 Светлана Александровна Митцева  

вопрос №5633

Здравствуйте. На данный момент мы проживем в Саратовской области. Дочь заканчивает 9 класс и унас ожидается переезд в Москву. Возможно ли нам поступить в Кадетскую школу государственных воспитанниц на волжский бульвар. Но у нас нет возможности сделать прописку до 1 июня для подачи документов.


25.05.2021 администратор

ответ на вопрос №5633

Здравствуйте, зачисление в 10-е  классы Корпуса  осуществляется в соответствии с «Положением о зачислении в 10-е профильные классы…», которое размещено на нашем официальном сайте в разделе Условия приема. На этой  же страничке сайта, есть подробная инструкция о подаче документов в 10-е классы.  

04.04.2021 Саломатин Константин Григорьевич  

вопрос №5632

Уважаемый Владимир Яковлевич! Благодарим от всего сердца за воспитание нашего сына Саломатина Ивана Константиновича. С уважением емья Саломатиных


05.04.2021 администратор

ответ на вопрос №5632

Уважаемый Константин Григорьевич! Благодарим Вас за оценку профессиональной деятельности педагогов Первого Московского кадетского корпуса. Желаем Вашему сыну достичь больших высот в служении Отечеству, здоровье и счастье всей Вашей семье!  

31.03.2021 Кабзов Юрий Викторович  

вопрос №5631

Здравствуйте! Может ли быть принят в 1КК ребёнок, имеющий второе гражданство? Спасибо.


05.04.2021 администратор

ответ на вопрос №5631

Здравствуйте, зачисление в кадетский корпус осуществляется в соответствии с Правилами приема, размещенными  на нашем официальном сайте. В первую очередь Вам необходимо подготовить пакет документов, указанный в данных правилах.

ГБОУ Первый Московский Кадетский корпус

Первый Московский Кадетский Корпус

 

— создан во исполнение Распоряжения Президента РФ от 9 апреля 1997 г. №118-рп, поддержавшего общественное движение в России за возрождение кадетской школы как системы подготовки юношей к служению Отечеству, для выполнения работ, оказания услуг в целях обеспечения реализации предусмотренных федеральными законами, законами города Москвы, нормативными правовыми актами Российской Федерации и Правительства Москвы, полномочий города Москвы в сфере образования. 

 

Учредителем Корпуса является город Москва. Функции и полномочия Учредителя Корпуса (далее — Учредитель) в соответствии с федеральными законами, законами города Москвы, нормативными правовыми актами Правительства Москвы осуществляет Департамент образования города Москвы, Северное окружное управление образования Департамента образования города Москвы в соответствии с переданными полномочиями.

 

Вышестоящий орган управления образованием — Северное окружное управление образования Департамента образования города Москвы. Собственником имущества Корпуса является город Москва.


Основной целью Корпуса является интеллектуальное, культурное, нравственное и физическое развитие кадет, их адаптация к жизни в обществе, формирование высокого патриотического сознания, создание основы для дальнейшего освоение профессиональных образовательных программ, направленных на подготовку к служению Отечеству на гражданском и военном поприще.

 

Корпус реализует общеобразовательные программы основного общего, среднего (полного) общего образования и дополнительные образовательные программы, направленные на физическое развитие кадет, их подготовку по основам военной службы и реализуемым профилям обучения.

 

Кадеты школы-интерната обеспечиваются в соответствии с установленными нормами одеждой, обувью, мягким инвентарем, предметами личной гигиены, а также учебниками, школьно-письменными принадлежностями, хозяйственным инвентарем.

 

На базе Корпуса проводятся окружные и городские семинары и круглые столы по кадетской тематике, воспитывающей деятельности, научно-исследовательские конференции, методические семинары различной проблематики. Ежегодно по обмену опытом Корпус принимает делегации кадетских корпусов из регионов РФ и ближнего зарубежья.

 

Корпус осуществил 12 выпусков и дал путёвку в жизнь 317 юношам, из них:

 

  • 60% поступили в военные вузы и академии,
  • 40% — в гражданские ВУЗы.
  • Около 70 выпускников являются действующими офицерами Вооружённых Сил Российской Федерации.

Режим дня


Режим дня, обеспечивающий научно обоснованное сочетание обучения, военной подготовки, труда и отдыха, составляется с учетом круглосуточного пребывания кадет в кадетской школе-интернате. Все классы учатся в одну смену. Режим работы – шестидневная неделя. По окончании учебного года проводятся выездные практические полевые занятия.

 

Учебный план Корпуса

 

5-летний срок освоения образовательных программ основного общего образования для 5-9 классов;

2-летний срок освоения образовательных программ среднего (полного) общего образования на основе сочетания базовых и профильных предметов для 10-11 классов.


В учреждении так же реализуются программы дополнительного образования. Многообразие видов дополнительных образовательных программ направлено на удовлетворение разнообразных интересов кадет, в соответствии с их способностями, склонностями и интересами, на освоение социального опыта, а также развитие профессионального самоопределения.

 

Регламент организации вступительных испытаний для поступающих в 5-е, 6-е и 7-е классы кадетских школ-интернатов, подведомственных Департаменту образования города Москвы

 

1. Вступительные испытания в форме тестирования проводятся для поступающих в 5-е, 6-е и 7-е классы государственных бюджетных образовательных учреждений кадетских школ-интернатов в два равноценных между собой потока:
— 25 марта 2014 г. по математике и 27 марта 2014 г. по русскому языку.
Для обучающихся, не принимавших участия в испытаниях в первом потоке:
— 08 апреля 2014 г. по математике и 10 апреля 2014 г. по русскому языку.


Время начала испытаний 10.00. Продолжительность — 45 минут по каждой дисциплине.


2. ГАУ «Московский центр качества образования»:


2.1. Разрабатывает проверочные материалы для проведения вступительных испытаний поступающих в 5-е, 6-е и 7-е классы кадетских школ-интернатов по математике и русскому языку.


2.2. До 10 февраля :
направляет в кадетские школы-интернаты планы проверочных работ по математике и русскому языку и инструктивные материалы для проведения вступительных испытаний: порядок подготовки и проведения вступительных испытаний поступающих в государственные кадетские школы-интернаты, инструкцию для организатора по проведению тестирования в ходе вступительных испытаний поступающих в кадетские школы-интернаты, образец бланка тестирования, инструкцию по заполнению бланка тестирования, инструкцию о порядке тестирования для учащегося.


2.3. В день проведения вступительных испытаний направляет в кадетские школы-интернаты наблюдателей с материалами для проведения вступительных испытаний.


2.4. 21 марта и 04 апреля 2014 г. размещает списки с кодами участников испытаний в личный кабинет образовательной организации (кадетской школы-интерната) в Московском регистре качества образования.


2.5. 07 апреля и 24 апреля 2014 г. размещает информацию о результатах испытаний в личных кабинетах образовательных организаций в Московском регистре качества образования.

 

127206, Москва, ул. Вучетича, дом 30, строение 1.

2МсКК Второй Московский кадетский корпус

Честь. Отечество. Доблесть.

Уважаемые родители!

В 2021-2022 учебном году Экспертно-консультативный совет родительской общественности совместно с колледжами, техникумами, подведомственными ДОНМ, планирует провести системное информирование родителей обучающихся о возможностях получения образования в государственных бюджетных профессиональных образовательных учреждениях.

Основная задача проекта — доступно и интересно рассказать вам о возможностях профессионального обучения, материально-технической базе современных колледжей и будущем профессий.

В рамках онлайн-мероприятий (длительностью не более часа) сотрудники колледжей подробно расскажут о следующих актуальных вопросах:

— по каким профессиям и специальностям проводится обучение, сроки обучения

— условия приема (вступительные испытания, конкурс и т.д.)

— как работают приемные комиссии

— формы обучения и практика

— перспективы трудоустройства выпускников, ожидаемые доходы

— возможности обучения для лиц с ОВЗ и инвалидностью

— социальная поддержка обучающихся

— организация студенческой общественной жизни, досуг

как развиваются профессии

— как дальше можно построить траекторию обучения и профессиональную траекторию после окончания колледжа

— востребованные профессии и тенденции

— достижения образовательной организации (участие в городских проектах, Worldskills и т.д.)

— проект Профессиональная среда в школе (если реализуется) — что дает при поступлении в колледж

— отличительные особенности (собственные проекты, новое оборудование, необычные формы обучения и т.д.)

Ждем от вас вопросов, которые вы можете направлять на почту [email protected] На них будут даны ответы в прямом эфире. Также будет возможность задать вопрос через чат в ходе мероприятия

Мероприятия будут проходить два раза в месяц в течение учебного года в соответствии с графиком (во вложении) в онлайн-формате на платформе Zoom.

Первое онлайн-мероприятие состоится 11.09.21 (суббота) в 11.00 часов

В рамках мероприятия пройдут презентации:

«Колледжа автомобильного транспорта № 9

«Московского автомобильно-дорожного колледжа им. А.А. Николаева»

«Колледжа железнодорожного и городского транспорта»

Номер вебинара: 83458097955

Будьте с нами! Много интересной и полезной информации:

Общегородское онлайн-совещание для родителей:

Открыт в соответствии с приказом Председателя Московского комитета образования от 8 июня 1999 года N 244-В, в 2013 году согласно приказа Департамента образования города Москвы от 31 июля 2013 г. № 426, в состав кадетского корпуса входят ТП «Обручевское» и ТП «Симферопольское», а сам кадетский корпус присоединен к ГБПОУ ТПСК им. В.М. Максимчука, в 2016 году ТП «Обручевское» сливается с ТП «Симферопольское» и весь кадетский корпус располагается по одному адресу.

Прощание со знаменем

Кадеты выходят из корпуса настоящими мужчинами, убеждёнными патриотами, достойными гражданами, защитниками Отечества.

Торжественная клятва кадета

Ежегодно самые лучшие и достойные воспитанники принимают торжественную клятву и посвящаются в кадеты Второго Московского Кадетского корпуса (МЧС).

Работают кружки

В корпусе работают кружки и секции: «Юный пожарный», «Маршевые барабаны», «Стендовый моделизм», «Шахматы», «Художественная самодеятельность», «Пожарно-прикладной спорт», «Театральный кружок», «Спортивные игры», «Киокусин кай каратэ», «Хореография», и т.д.

Первый Московский кадетский корпус — 30 отзывов

Государственное казенное общеобразовательное учреждение

Адрес: Москва, 4-й Новомихалковский проезд, 14, стр. 3

Адрес: Москва, Волжский бульвар, 52/29, стр.1
(м. Волжская) Адрес: Москва, Кастанаевская улица, дом 59, к. 1
(м. Кунцевская)

Директор: Крымский Владимир Яковлевич

Аналитика ЕГЭ: !!! Уже много лет администрация школы не обновляет в своих отчетах результаты по среднему баллу ЕГЭ, а почему — решайте сами. Диплом для школьного сайта: (по стране), (по району)

23 отзыва о Кадетская школа-интернат №1, kdsch2s.mskobr.ru

Уважаемые родители! Вы, как мне кажется, забываете одну принципиально значимую вещь. Первый МКК не задумывался как ультрапрестижное учебное заведение для возлюбленных чад сильных мира сего, в коем качестве он, по не вполне понятным мне (да и не только мне) причинам позиционируется некоторыми товарищами в настоящий момент. Изначально, да осмелюсь я заявить, он задумывался для детей (и родителей, разумеется), ставящих в приоритет вещи, в корне отличные от, так сказать, современных ценностей российского общества, как то — долг, честь, совесть, любовь к Родине и прочие непрактичные, неудобные и совершенно неликвидные вещи. И эти вещи, поверьте мне, витали в не слишком просторных коридорах старого здания корпуса без всяких для себя помех, пока корпус не стал популярен и, как неизбежное следствие, престижен, после чего в него стали набиваться детишки, до этого приговоренные к отбыванию обучения в дорогих частных школах. Вы говорите — отвратительное питание. Да, действительно, воображение оно не поражало никогда, но если вы хотите, чтобы ваш цветок жизни питался на обед лазаньей — идите в эту самую частную школу, черт вас дери! Антисанитария — извините, в корпусе всегда было принято, чтобы парни сами убирали за собой свое, извините, дерьмо. Если Ваше чадо ужасает мысль самостоятельно постирать свои трусы — ему там не место. Если вы думаете, что корпус сделает из Вашего ребенка то, что Вам нужно, без какого-либо Вашего участия — это просто глупо. Сделайте одолжение себе и вашим пацанам — подумайте, прежде чем отдавать их в Корпус. то, что Ваш любимый мальчик будет ходить в красивой форме, несомненно, сделает Вас гордыми и счастливыми. А вот самого мальчика — не обязательно. И, да, разумеется, можно сделать из дерьма конфетку, но она, скорее всего, будет невкусной. Если Вы забывали или Вам не позволяла занятость воспитывать ваше дитё до его десяти лет, Корпус не наверстает упущенное. И дело вовсе не в том, что там невкусно кормят или плохо убираются.

Нарушение регуляции ангиогенез-специфической передачи сигналов в семенниках взрослых приводит к дегенерации ксенотрансплантата.

  • 1.

    Honaramooz, A. et al. . Сперма из семенников новорожденных млекопитающих, пересаженных мышам. Природа 418 , 778–781, DOI: 10.1038 / nature00918 (2002).

    ADS CAS Статья PubMed Google ученый

  • 2.

    Шмидт, Дж. А., де Авила, Дж. М. и Маклин, Д.J. Анализ экспрессии генов в ткани семенников крупного рогатого скота до ксенотрансплантации внематочной ткани семенников и во время периода трансплантации. Биология размножения 76 , 1071–1080, DOI: 10.1095 / biolreprod.106.058222 (2007).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 3.

    Jahnukainen, K., Ehmcke, J. & Schlatt, S. Ксенотрансплантаты яичек: новый подход к изучению цитотоксического повреждения семенников молодых приматов. Рак Res 66 , 3813–3818, DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-05-3754 (2006).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 4.

    Хонарамос, А., Ли, М. В., Пенедо, М. К., Мейерс, С. и Добрински, И. Ускоренное созревание семенников приматов путем ксенотрансплантации мышам. Биология размножения 70 , 1500–1503, DOI: 10.1095 / биолрепрод.103.025536 (2004).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 5.

    Оатли, Дж. М., де Авила, Д. М., Ривз, Дж. Дж. И Маклин, Д. Дж. Сперматогенез и экспрессия трансгена зародышевых клеток в ксенотрансплантатной ткани яичка крупного рогатого скота. Биология размножения 71 , 494–501, DOI: 10.1095 / biolreprod.104.027953 (2004).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 6.

    Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W., Schlatt, S. & Dobrinski, I. Судьба зародышевых клеток и развитие семенных канальцев в ксенотрансплантатах семенников крупного рогатого скота. Репродукция 130 , 923–929, DOI: 10.1530 / rep.1.00912 (2005).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 7.

    Редди, Н. и др. . Статус гонад самцов мышей-реципиентов влияет на развитие зародышевых клеток в незрелом ксенотрансплантате ткани семенников буйвола. Репродукция 143 , 59–69, DOI: 10.1530 / REP-11-0286 (2012).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 8.

    Abrishami, M., Abbasi, S. & Honaramooz, A. Влияние возраста донора на прогрессирование сперматогенеза в ткани яичек собак после ксенотрансплантации иммунодефицитным мышам. Териогенология 73 , 512–522, DOI: 10.1016 / j.theriogenology.2009.09.035 (2010).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 9.

    Snedaker, A. K., Honaramooz, A. & Dobrinski, I. Игра в кошки-мышки: ксенотрансплантация ткани семенников от домашних котят приводит к полному сперматогенезу кошки у мыши-хозяина. Дж Андрол 25 , 926–930, DOI: 10.1002 / j.1939-4640.2004.tb03163.x (2004).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 10.

    Шлатт С., Ким С. и Госден Р. Сперматогенез и стероидогенез в ткани яичек мышей, хомяков и обезьян после криоконсервации и гетеротопической трансплантации кастрированным хозяевам. Репродукция 124 , 339–346, DOI: 10.1530 / rep.0.1240339 (2002).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 11.

    Shinohara, T. et al. . Рождение потомства после трансплантации криоконсервированных незрелых кусочков семенников и микроопыления in vitro . Hum Reprod 17 , 3039–3045, DOI: 10.1093 / humrep / 17.12.3039 (2002).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 12.

    Орвиг, К. Э. и Шлатт, С. Криоконсервация и трансплантация сперматогониев и ткани яичек для сохранения мужской фертильности. J Natl Cancer Inst Monogr 51–56, DOI: 10.1093 / jncimonographs / lgi029 (2005).

  • 13.

    Блоттнер С., Хингст О. и Мейер Х. Х. Обратная связь между пролиферацией яичек и апоптозом у сезонных заводчиков млекопитающих. Териогенология 44 , 321–328, DOI: 10.1016 / 0093-691X (95) 00187-D (1995).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 14.

    Turner, RM, Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. & Dobrinski, I. Ксенотрансплантат восстанавливает сперматогенез в ткани яичка крипторхидов, но не спасает фенотип идиопатической дегенерации яичек у лошади ( Equus caballus). Репрод Fertil Dev 22 , 673–683, DOI: 10.1071 / RD09014 (2010).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 15.

    Schlatt, S. et al. . Ограниченная выживаемость тестикулярной ткани взрослого человека как эктопического ксенотрансплантата. Репродукция человека (Оксфорд, Англия) 21 , 384–389, DOI: 10.1093 / humrep / dei352 (2006).

    CAS Статья Google ученый

  • 16.

    Geens, M. et al. . Сперматогониальная выживаемость после пересадки ткани яичек человека иммунодефицитным мышам. Hum Reprod 21 , 390–396, DOI: 10.1093 / humrep / dei412 (2006).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 17.

    Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W., Turner, R. & Dobrinski, I. Развитие зародышевых клеток в ткани семенников лошади, ксенотрансплантированных мышам. Репродукция 131 , 1091–1098, DOI: 10.1530 / rep.1.01101 (2006).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 18.

    Arregui, L. et al. . Ксенотрансплантация ткани семенников взрослых млекопитающих. Наука о воспроизводстве животных 106 , 65–76, DOI: 10.1016 / j.anireprosci.2007.03.026 (2008).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 19.

    Schlatt, S., Ким С. и Госден Р. Сперматогенез и стероидогенез в ткани яичек мышей, хомяков и обезьян после криоконсервации и гетеротопической трансплантации кастрированным хозяевам. Репродукция 124 , 339–346, DOI: 10.1530 / rep.0.1240339 (2002).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 20.

    Укузян А.А., Гассман А.А., Ист, А.Т. и Грейслер, Х.П. Молекулярные медиаторы ангиогенеза. Журнал ожоговых исследований и исследований: официальное издание Американской ожоговой ассоциации 31 , 158–75, DOI: 10.1097 / BCR.0b013e3181c7ed82 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 21.

    Матоба С. и Огура А. Генерация функциональных ооцитов и сперматид из первичных зародышевых клеток плода после эктопической трансплантации взрослым мышам. Биология размножения 84 , 631–638, DOI: 10.1095 / биолрепрод.110.087122 (2011).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 22.

    Schlatt, S., Westernströer, B., Gassei, K. & Ehmcke, J. Вовлечение донора и хозяина в ксенотрансплантацию неполовозрелого семенника крысы в ​​хозяина голой мыши. Биология размножения 82 , 888–895, DOI: 10.1095 / biolreprod.109.082073 (2010).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 23.

    Шлатт С., Хонарамос А., Бояни М., Шолер Х. Р. и Добрински И. Потомство из сперматозоидов, полученных после эктопической трансплантации семенников новорожденных мышей. Биология размножения 68 , 2331–2335, DOI: 10.1095 / biolreprod.102.014894 (2003).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 24.

    Митчелл, Р. Т. и др. . Ксенотрансплантация ткани семенников плода человека: новый подход к изучению развития семенников плода и дифференцировки половых клеток. Hum Reprod 25 , 2405–2414, DOI: 10.1093 / humrep / deq183 (2010).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 25.

    Хонарамос, А., Ли, М.-В., Пенедо, М. К. Т., Мейерс, С. и Добрински, И. Ускоренное созревание семенников приматов путем ксенотрансплантации мышам 1. Биология размножения 70 , 1500–1503, DOI: 10.1095 / биолрепрод.103.025536 (2004).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 26.

    Бойл П. Ф., Фокс М. и Слейтер Д. Трансплантация интерстициальных клеток яичка: влияние места имплантации, массы трансплантата и ишемии. Br J Урол 47 , 891–898, DOI: 10.1111 / bju.1975.47.issue-7 (1975).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 27.

    Макала, Х., Потана, Л., Сонам, С., Малла, А. и Гоэль, С. Регенерация клеток Лейдига в семенниках взрослых мышей, подвергшихся эктопической аутотрансплантации. Репродукция 149 , 259–268, DOI: 10.1530 / REP-14-0576 (2015).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 28.

    Miragem, A. et al. . Подкожная трансплантация аутологичного яичка крысам Вистар. Инт Урол Нефрол 41 , 313–318, DOI: 10.1007 / s11255-008-9465-1 (2009).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 29.

    О’Доннелл, Л., Мичем, С.Дж., Стэнтон, П.Г., Маклахлан, Р.И. В Физиология репродукции Кнобила и Нила , третье издание (изд. JD (ред.) В: Нил) стр. 1017–1069 (Elsevier Academic Press, 2006).

  • 30.

    Arregui, L. & Dobrinski, I. Ксенотрансплантация кусочков ткани яичка: 12 лет системы сперматогенеза in vivo . Репродукция 148 , R71–84, DOI: 10.1530 / REP-14-0249 (2014).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 31.

    Рати, Р. и др. . Созревание ткани яичек детенышей обезьян после ксенотрансплантации мышам. Эндокринология 149 , 5288–5296, DOI: 10.1210 / en.2008-0311 (2008).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Осборн, С. Л., Со, М., Хамбро, С., Нолта, Дж. А. и Курцрок, Э. А. Иноскуляция кровеносных сосудов обеспечивает раннюю перфузию и жизнеспособность трансплантатов мочевого пузыря — последствия для биоинженерной стенки мочевого пузыря. Тканевая инженерия. Часть A 21 , 1906–1915, DOI: 10.1089 / ten.tea.2014.0630 (2015).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Crivellato, E.Роль ангиогенных факторов роста в органогенезе. Международный журнал биологии развития 55 , 365–375, DOI: 10.1387 / ijdb.103214ec (2011).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 34.

    Феррара, Н. Фактор роста эндотелия сосудов: молекулярные и биологические аспекты. Актуальные темы микробиологии и иммунологии 237 , 1–30 (1999).

    CAS PubMed Google ученый

  • 35.

    Schmidt, J. A., de Avila, J. M. & McLean, D. J. Влияние фактора роста эндотелия сосудов и культуры ткани семенников на сперматогенез в ксенотрансплантатах эктопической ткани семенников крупного рогатого скота. Биология размножения 75 , 167–175, DOI: 10.1095 / biolreprod.105.049817 (2006).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 36.

    Феррара, Н. Роль фактора роста эндотелия сосудов в регуляции ангиогенеза. Почки Int 56 , 794–814, DOI: 10.1046 / j.1523-1755.1999.00610.x (1999).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 37.

    Andrae, J., Gallini, R. & Betsholtz, C. Роль факторов роста, полученных из тромбоцитов, в физиологии и медицине. Гены и развитие 22 , 1276–1312, DOI: 10.1101 / гад.1653708 (2008).

    CAS Статья Google ученый

  • 38.

    Sato, N. et al. . Фактор роста тромбоцитов косвенно стимулирует ангиогенез in vitro . Американский журнал патологии 142 , 1119–1130 (1993).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Гнесси, Л. и др. . Развитие яичек включает пространственно-временной контроль экспрессии и действия генов PDGF и рецепторов PDGF. Журнал клеточной биологии 131 , 1105–21, DOI: 10.1083 / jcb.131.4.1105 (1995).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 40.

    Smith, F. F., Tres, L. L. & Kierszenbaum, A. L. Активность орнитиндекарбоксилазы во время сперматогенеза крыс in vivo и in vitro : селективный эффект гормонов и факторов роста. Журнал клеточной физиологии 133 , 305–312, DOI: 10.1002 / jcp.1041330214 (1987).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 41.

    Mehta, D. et al. . Наружное стентирование снижает долгосрочное утолщение медиальной и неоинтимальной областей и экспрессию тромбоцитарного фактора роста в модели артериовенозного шунтирования свиней. Природное лекарство 4 , 235–239, DOI: 10.1038 / нм0298-235 (1998).

    ADS CAS Статья PubMed Google ученый

  • 42.

    Fukuhara, S. et al . Передача сигналов рецептора ангиопоэтина-1 / Tie2 при покое сосудов и ангиогенезе. Гистол Гистопатол 25 , 387–396, DOI: 10.14670 / HH-25.387 (2010).

    CAS PubMed Google ученый

  • 43.

    Рыбак, С. М., Фетт, Дж. У., Яо, К. З. и Валле, Б. Л. мРНК ангиогенина в опухолевых и нормальных клетках человека. Biochem Biophys Res Commun 146 , 1240–1248, DOI: 10.1016 / 0006-291X (87) -9 (1987).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 44.

    Дальбак Б. Свертывание крови и ее регуляция антикоагулянтными путями: генетический патогенез кровотечений и тромботических заболеваний. J Intern Med 257 , 209–223, DOI: 10.1111 / j.1365-2796.2004.01444.x (2005).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 45.

    Zhang, J. C. et al. . Анализ мышей с дефицитом SM22alpha раскрывает неожиданное понимание дифференцировки и функции гладкомышечных клеток. Mol Cell Biol 21 , 1336–1344, DOI: 10.1128 / MCB.2001.21.4.1336-1344.2001 (2001).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 46.

    Де Лука, А. и др. . Роль передачи сигналов EGFR в микросреде опухоли. Журнал клеточной физиологии 214 , 559–567, DOI: 10.1002 / jcp.21260 (2008).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 47.

    Ли, Ф. и др. . Экспрессия белков EGFR и COX-2 при немелкоклеточном раке легкого и корреляция с клиническими особенностями. Журнал экспериментальных и клинических исследований рака: CR 30 , 27–27, DOI: 10.1186 / 1756-9966-30-27 (2011).

    Артикул PubMed Central Google ученый

  • 48.

    Сасаки Т., Хироки К. и Ямасита Ю. Роль рецептора эпидермального фактора роста в метастазах рака и микросреде. BioMed Research International 2013 , 546318–8, DOI: 10.1155 / 2013/546318 (2013).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 49.

    Молиноло А.А. и др. . Нарушение регуляции молекулярных сетей в канцерогенезе головы и шеи. Онкология полости рта 45 , 324–334, DOI: 10.1016 / j.oraloncology.2008.07.011 (2009).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 50.

    Датта П. Р. и Мэйти А. Клеточные ответы на ингибиторы EGFR и их значение для лечения рака. Письма о раке 254 , 165–177, DOI: 10.1016 / j.canlet.2007.02.006 (2007).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 51.

    Lin, C.-M. и др. . Функциональная роль вогонина в антиангиогенезе. Американский журнал китайской медицины 40 , 415–427, DOI: 10,1142 / s0192415x12500322% m22419433 (2012).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 52.

    Чен, З. и Хан, З. С. STAT3: критический активатор транскрипции в ангиогенезе. Обзоры медицинских исследований 28 , 185–200, DOI: 10.1002 / med.20101 (2008).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 53.

    Шефер, Л. К., Рен, З., Фуллер, Г. Н. и Шефер, Т. С. Конститутивная активация Stat3alpha в опухолях головного мозга: локализация в эндотелиальных клетках опухоли и активация рецептором эндотелиальной тирозинкиназы (VEGFR-2). Онкоген 21 , 2058–2065, DOI: 10.1038 / sj.onc.1205263 (2002).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 54.

    Schuringa, JJ, Jonk, LJ, Dokter, WH, Vellenga, E. & Kruijer, W. Интерлейкин-6-индуцированная трансактивация STAT3 и фосфорилирование Ser727 вовлекают Vav, Rac-1 и киназу SEK-1 / MKK-4 в качестве сигнала. компоненты трансдукции. Биохимический журнал 347 , 89–96, DOI: 10.1042 / bj3470089 (2000).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 55.

    Lysiak, J.J. и др. . Индуцируемый гипоксией фактор-1альфа конститутивно экспрессируется в клетках Лейдига мышей и регулирует активность промотора 3-гидроксистероиддегидрогеназы типа 1. Дж Андрол 30 , 146–156, DOI: 10.2164 / jandrol.108.006155 (2009).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 56.

    Jaakkola, P. et al . Нацеливание HIF-альфа на комплекс убиквитилирования фон Хиппеля-Линдау посредством O2-регулируемого гидроксилирования пролила. Наука 292 , 468–472, DOI: 10.1126 / science.1059796 (2001).

    ADS CAS Статья PubMed Google ученый

  • 57.

    Иван М. и др. . HIFalpha направлен на VHL-опосредованное разрушение путем гидроксилирования пролина: последствия для восприятия O2. Наука 292 , 464–468, DOI: 10.1126 / science.1059817 (2001).

    ADS CAS Статья PubMed Google ученый

  • 58.

    Джуэлл, У. Р. и др. . Индукция HIF-1альфа в ответ на гипоксию происходит мгновенно. FASEB J 15 , 1312–1314 (2001).

    CAS PubMed Google ученый

  • 59.

    Райан, Х. Э. и др. . Фактор-1α, индуцируемый гипоксией, является положительным фактором роста солидных опухолей. Исследования рака 60 , 4010–4015 (2000).

    CAS PubMed Google ученый

  • 60.

    Робертс П. Дж. И Дер С. Дж. Нацеливание на каскад митоген-активируемых протеинкиназ Raf-MEK-ERK для лечения рака. Онкоген 26 , 3291–3310, DOI: 10.1038 / sj.onc.1210422 (0000).

    Артикул Google ученый

  • 61.

    Ларчер, Ф. и др. .Модуляция ответа ангиогенеза посредством контроля Ha-ras, фактора роста плаценты и экспрессии ангиопоэтина в канцерогенезе кожи мышей. Молекулярный канцерогенез 37 , 83–90, DOI: 10.1002 / mc.10126 (2003).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 62.

    Mazure, NM, Chen, EY, Laderoute, KR & Giaccia, AJ Индукция фактора роста эндотелия сосудов посредством гипоксии модулируется сигнальным путем фосфатидилинозитол-3-киназы / Akt в Ha-ras-трансформированных клетках через транскрипционный элемент индуцируемого гипоксией фактора-1. Кровь 90 , 3322–3331 (1997).

    CAS PubMed Google ученый

  • 63.

    Сербан, Д., Ленг, Дж. И Череш, Д. H-ras регулирует ангиогенез и проницаемость сосудов путем активации отдельных нижестоящих эффекторов. Исследование обращения 102 , 1350–1358, DOI: 10.1161 / CIRCRESAHA.107.169664 (2008).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 64.

    Сантарпиа, Л., Липпман, С. М. и Эль-Наггар, А. К. Нацеливание на сигнальный путь MAPK-RAS-RAF в терапии рака. Экспертное заключение по терапевтическим целям 16 , 103–119, DOI: 10.1517 / 14728222.2011.645805 (2012).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 65.

    Crews, C. M., Alessandrini, A. & Erikson, R. L. Первичная структура MEK, протеинкиназы, которая фосфорилирует продукт гена ERK. Наука 258 , 478–480, DOI: 10.1126 / science.1411546 (1992).

    ADS CAS Статья PubMed Google ученый

  • 66.

    Tian, ​​T. et al. . PTEN регулирует ангиогенез и экспрессию VEGF через фосфатазозависимые и независимые механизмы в клетках HepG2. Канцерогенез 31 , 1211–1219, DOI: 10.1093 / carcin / bgq085 (2010).

    Артикул PubMed Google ученый

  • 67.

    Карар, Дж. И Мэйти, А. Путь PI3K / AKT / mTOR в ангиогенезе. Границы молекулярной неврологии 4 , 51, DOI: 10.3389 / fnmol.2011.00051 (2011).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 68.

    Hiepen, C. et al. .BMP2-индуцированный хемотаксис требует PI3K p55γ / p110α-зависимой продукции фосфатидилинозит (3,4,5) -трифосфата и привлечения LL5β в цитокортексе. Биология BMC 12 , 43–43, DOI: 10.1186 / 1741-7007-12-43 (2014).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 69.

    Мид, Х., Зеремски, М. и Губа, М. В mTOR Pathway и ингибиторы mTOR в терапии рака (ред. Виталий А.Полуновский и Питер Дж. Хоутон) 49–74 (Humana Press, 2010).

  • 70.

    Babaei, S. et al . Ангиогенные действия ангиопоэтина-1 требуют оксида азота, производного эндотелием. Американский журнал патологии 162 , 1927–1936, DOI: 10.1016 / S0002-9440 (10) 64326-X (2003).

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 71.

    Фукумура, Д. и др. . Преобладающая роль эндотелиальной синтазы оксида азота в ангиогенезе и проницаемости сосудов, индуцированном фактором роста эндотелия сосудов. Proc Natl Acad Sci USA 98 , 2604–2609, DOI: 10.1073 / pnas.041359198 (2001).

    ADS CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 72.

    Потана, Л., Макала, Х., Деви, Л., Варма, В. П., Гоэль, С.Дифференцировка зародышевых клеток в криоконсервированных, незрелых семенниках индийских пятнистых мышей (Moschiola indica), ксенотрансплантированных мышам. Териогенология 83 , 625–633, DOI: 10.1016 / j.theriogenology.2014.10.028 (2015).

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 8- (Тозиламино) хинолин подавляет опосредованное макрофагами воспаление путем подавления передачи сигналов NF-κB

    Материалы

    Тестируемые соединения с 1 по 7 были приобретены у Sigma-Aldrich Co (Сент-Луис, Миссури, США) в количестве более 95%. чистота.Карбоксиметилцеллюлоза натрия (NaCMC), полиэтиленгликоль 400, (3-4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), GM-CSF и LPS ( E coli 0111: B4) были также получен от Sigma. LY294002 (LY), BAY11-7082 (BAY), U0126 и вортманнин были от Calbiochem (Ла-Холла, Калифорния, США). Люциферазные конструкции, содержащие промоторы связывания для NF-κB и AP-1, использовали, как сообщалось ранее 12,13 . Наборы для иммуноферментного анализа (EIA) и наборы для иммуноферментного анализа (ELISA) для PGE 2 и TNF-α были приобретены в Amersham (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK).Фетальная бычья сыворотка и среда RPMI-1640 были получены от GIBCO (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Клетки RAW264.7 были приобретены в ATCC (Роквилл, Мэриленд, США). Все остальные химические вещества были реактивными сортами Sigma. Фосфоспецифические или общие антитела к факторам транскрипции (p65, p50, c-Jun, STAT-1 и c-Fos), ERK (внеклеточная сигнальная киназа), p38, JNK (c-Jun N-концевая киназа), IκBα, IKKβ, Akt, p85 / PI3K, γ-тубулин, β-актин и нерецепторные тирозинкиназы (Src и Syk) были получены от Cell Signaling Technology Inc (Беверли, Массачусетс, США).

    Животные

    Самцов мышей C57BL / 6 (возраст 6-8 недель, 17-21 г) были получены от Dae Han Bio Link Co Ltd, Чунгбук, Корея, и содержались в пластиковых клетках в обычных условиях. Рационы на воде и гранулах (Samyang Corp, Тэджон, Корея) были доступны ad libitum . Исследования проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Кангвон.

    Приготовление перитонеальных макрофагов и макрофагов костного мозга

    Перитонеальный экссудат был получен от мышей-самцов C57BL / 6 (возраст 7-8 недель, 17-21 г) промыванием через 4 дня после внутрибрюшинной инъекции 1 мл стерильного 4% раствора. бульон тиогликолата (Difco Laboratories, Детройт, штат Мичиган, США), как сообщалось ранее 14,15 .После промывания средой RPMI-1640, содержащей 2% FBS, перитонеальные макрофаги (1 × 10 6 клеток / мл) высевали в 100-миллиметровые чашки для тканевых культур на 4 часа при 37 ° C в увлажненной 5% CO 2 . Атмосфера. Для приготовления макрофагов, полученных из костного мозга, у мышей выделяли бедренные и большеберцовые кости и удаляли мышцу. Кости разрезали ножницами с обоих концов и промывали 5 мл RPMI-1640 иглой 25-го размера. Клетки высевали с плотностью 2 × 10 5 ядерных клеток костного мозга / см 2 в RPMI-1640, содержащем 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина, 0.1 мг / мл стрептомицина, 2 ммоль / л L-глутамина и 50 нг / мл GM-CSF в 6-луночных планшетах CellBIND (Corning Life Sciences, Лоуэлл, Массачусетс, США), содержащих 3 мл на лунку. После 24-часовой инкубации клетки промывали три раза 3 мл RPMI-1640 для удаления неприлипающих клеток и культивировали далее с 3 мл RPMI-1640, содержащего 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина, 0,1 мг / мл. мл стрептомицина, 2 ммоль / л , л -глутамина и 50 нг / мл GM-CSF, далее именуемые «полная среда». Среду для культивирования клеток заменяли каждые 3 дня свежей полной средой.После 3 недель культивирования эксперименты проводили в бессывороточном RPMI-1640, содержащем 50 нг / мл GM-CSF и указанные добавки.

    Культура клеток

    Перитонеальные макрофаги и клеточные линии (клетки RAW264.7 и HEK293) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Гибко, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), глутамина и антибиотики (пенициллин и стрептомицин) при 37 ° C и 5% CO 2 . Для каждого эксперимента клетки отделяли скребком для клеток.При нашей экспериментальной плотности клеток (2 × 10 6 клеток / мл) доля мертвых клеток была менее 1% в соответствии с тестами на исключение красителя трипанового синего.

    Продукция NO, PGE

    2 и TNF-α

    После предварительной инкубации клеток RAW264.7 или перитонеальных макрофагов (1 × 10 6 клеток / мл) в течение 18 часов, клетки предварительно обрабатывали тестом соединения с 1 по 7 в течение 30 минут, а затем инкубировали с LPS (1 мкг / мл) в течение 24 часов. Ингибирующее действие тестируемых соединений на продукцию NO, PGE 2 и TNF-α определяли путем анализа уровней NO, PGE 2 и TNF-α с помощью реагента Грисса и иммуноферментного анализа (ELISA). наборы, как описано ранее 16,17,18 .

    Тест жизнеспособности клеток

    Клетки RAW264.7 (1 × 10 6 клеток / мл) предварительно инкубировали в течение 18 часов, а затем инкубировали в течение 24 часов после добавления к клеткам тестируемых соединений с 1 по 7. Цитотоксические эффекты оценивали с помощью теста МТТ 19 . За 3 часа до прекращения культивирования добавляли 10 мкл раствора МТТ (10 мг / мл в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4), и клетки возвращали в культуру до конца эксперимента. Инкубацию останавливали добавлением 15% додецилсульфата натрия в каждую лунку для растворения формазана 20 .Оптическую плотность при 570 нм (OD 570-630 нм ) измеряли с использованием считывающего устройства для микропланшетов SpectraMax 250.

    Анализ мРНК

    с помощью полуколичественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

    Для определения уровней экспрессии мРНК цитокинов общую РНК выделяли из обработанных LPS клеток RAW264.7 с помощью реагента TRIzol (Gibco BRL) в соответствии с инструкции производителя. Суммарную РНК хранили при -70 ° C до использования. Анализ мРНК также выполняли с использованием полуколичественной ОТ-ПЦР в соответствии с инструкциями производителя (Bioneer, Daejeon, Корея), как сообщалось ранее 21 .Результаты выражали как отношение оптической плотности при 280 нм к концентрации мРНК GAPDH. Используемые праймеры (Bioneer) перечислены в таблице 1.

    Таблица 1 Праймеры для генов, исследованных с помощью анализа RT-PCR.

    Анализ активности репортерного гена люциферазы

    Клетки HEK293 (1 × 10 6 клеток / мл) трансфицировали 1 мкг плазмиды NF-κB-Luc, CREB-Luc или AP-1-Luc в дополнение к β -галактозидазная плазмида в присутствии или в отсутствие конструкции Akt с использованием полиэтилениминового метода в 12-луночном планшете в соответствии с протоколом производителя 22 .Клетки использовали для экспериментов через 48 ч после трансфекции. Люциферазные анализы проводили с использованием системы анализа люциферазы (Promega), как описано ранее 23,24 .

    Приготовление общих лизатов и ядерных фракций, иммуноблоттинг и иммунопреципитация

    Клетки RAW264.7 (5 × 10 6 клеток / мл) или печень промывали 3 раза в холодном PBS с 1 ммоль / л ортованадата натрия и лизировали в буфер для лизиса (20 ммоль / л трис-HCl, pH 7,4, 2 ммоль / л EDTA, 2 ммоль / л этиленгликотетрауксусная кислота, 50 ммоль / л β-глицерофосфат, 1 ммоль / л ортованадат натрия, 1 ммоль / л дитиотреитол, 1% Triton X-100, 10% глицерин, 10 мкг / мл апротинина, 10 мкг / мл пепстатина, 1 ммоль / л бензимида и 2 ммоль / л PMSF) в течение 30 мин с вращением при 4 ° C.Лизаты осветляли центрифугированием при 16 000 × g в течение 10 мин при 4 ° C и хранили при -20 ° C до тех пор, пока они не понадобились.

    Ядерные лизаты получали по трехступенчатой ​​процедуре 25 . После обработки клетки собирали резиновым полицейским, промывали 1 × PBS и лизировали в 500 мкл буфера для лизиса на льду в течение 4 мин. Затем клеточные лизаты центрифугировали при 19326 × g в течение 1 мин в микроцентрифуге. На втором этапе осадок (ядерная фракция) промывали один раз в промывочном буфере, который был таким же, как буфер для лизиса без Nonidet P-40.На заключительном этапе ядра обрабатывали буфером для экстракции, содержащим 500 ммоль / л KCl, 10% глицерин и несколько других реагентов, как в буфере для лизиса. Смесь ядра / буфер для экстракции замораживали при -80 ° C, размораживали на льду и центрифугировали при 19326 × g в течение 5 мин. Супернатант собирали как ядерный экстракт.

    Для иммунопреципитации клеточные лизаты, содержащие равные количества белка (500 мкг) из клеток RAW264.7, культивируемых при концентрации 1 × 10 7 клеток / мл и обработанных или не обработанных LPS (1 мкг / мл) для 2.В течение 5 минут предварительно очищали 10 мкл гранул сефарозы, связанной с протеином А (50% об. / Об. ) (Amersham, UK) в течение 1 часа при 4 ° C. Предварительно очищенные образцы инкубировали с 5 мкл антитела против Akt в течение ночи при 4 ° C. Иммунные комплексы смешивали с 10 мкл шариков сефарозы, связанной с протеином А (50% vv ), и перемешивали вращением в течение 3 ч при 4 ° C.

    Растворимые клеточные лизаты или вареные иммунопреципитированные шарики анализировали с помощью вестерн-блоттинга, а фосфорилированные или общие факторы транскрипции (p65, c-Jun и c-Fos), белки MAPK (ERK, p38 и JNK), IκBα, IKKα / β, Akt, p85 / PI3K, PDK1, γ-тубулин, β-актин и нерецепторные тирозинкиназы (Src и Syk) визуализировались, как сообщалось ранее 26 .

    Анализы киназ Akt и PI3K

    Для оценки ингибирующей активности киназ Akt и PI3K в экстрактах с использованием очищенных ферментов, служба профилирования киназ от Millipore (http://www.millipore.com/life_sciences/flx4/ld_kinases) использовался. В конечном реакционном объеме 25 мкл белок Akt (1, 2 и 3) или PI3K (α, β и γ; человеческий; 1–5 мЕд) инкубировали с реакционным буфером. Реакцию инициировали добавлением MgATP. После 40 мин инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 5 мл 3% раствора фосфорной кислоты.Затем десять микролитров продукта реакции наносили каплями на фильтровальный мат GF / P30 (PerkinElmer, Inc), который затем промывали три раза в течение 5 минут фосфорной кислотой 75 ммоль / л и один раз метанолом перед сушкой и сцинтилляционным счетом.

    EtOH / HCl-гастрит, LPS-индуцированный гепатит и тесты на острую токсичность

    Воспаление желудка индуцировали EtOH / HCl в соответствии с опубликованным методом 27 . Натощак мышей ICR перорально обрабатывали соединением 7 (от 10 до 40 мг / кг) или ранитидином (40 мг / кг), суспендированным в 5% NaCMC.Тридцать минут спустя перорально вводили 400 мкл 60% этанола в 150 ммоль / л HCl. Каждое животное было умерщвлено передозировкой уретана через 1 час после введения некротизирующих агентов. Желудок был вырезан и осторожно промыт под проточной водой из-под крана. После вскрытия желудка по большей кривизне и его распределения на доске с помощью счетчика пикселей измеряли площадь ( 2 мм) эрозивных поражений слизистой оболочки. Воспаление печени было вызвано инъекцией LPS в соответствии с опубликованным методом 28 .Натощак мышей C57BL / 6 перорально обрабатывали соединением 7 (20 мг / кг) один раз в день в течение 6 дней. Через час после последнего введения ЛПС (10 мг / кг) вводили внутрибрюшинно. Каждое животное анестезировали передозировкой уретана через 1 ч после введения индукторов гепатита и брали кровь из воротной вены. Затем печень вырезали и осторожно промывали проточной водой из-под крана. Сыворотку получали центрифугированием крови при 3000 об / мин в течение 15 мин. Уровни сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) измеряли с помощью спектрофотометрического автоанализатора Roche Modular.В испытании на острую токсичность соединение 7 растворяли в 20% ПЭГ 400, разведенном в 5% БСА в H 2 О или суспендировали в 5% NaCMC и вводили перорально или внутрибрюшинно. Летальность и изменение массы тела определяли через 7 дней.

    Статистический анализ

    Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD), по крайней мере, из трех независимых экспериментов, каждый из которых выполнен в трех экземплярах, или являются репрезентативными для трех разных экспериментов с аналогичными результатами. Для статистического сравнения результаты были проанализированы с использованием дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия Шеффе и U-критерия Краскела-Уоллиса / Манна-Уитни.Значение P <0,05 считалось значимым. Все статистические тесты проводились с использованием SPSS (Статистический пакет для социальных наук, SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс, США).

    Дом

    Детали
    Категория: Новости / Пресс-релиз

    ЛАГЕРЬ БГЕН ОСКАР М. ФЛОРЕНДО — Региональное отделение полиции 1 обязалось предоставить вспомогательные склады в Полевом отделении 1 Департамента социального обеспечения и развития, чтобы поддержать мандат отдела по оказанию помощи нашим собратьям-филиппинцам во время стихийных бедствий.

    PRO1 через PBGEN EMMANUEL B PERALTA, региональный директор, подписал сегодня Меморандум о соглашении с полевым офисом DSWD 1, региональным директором Марией Анжелой С. Гопалан, чтобы укрепить их партнерские отношения для более быстрого и эффективного предоставления услуг, особенно во время чрезвычайных ситуаций и природных явлений. бедствия.

    Указанное Министерство сельского хозяйства будет поддерживать инициативы DSWD по принятию скоординированного подхода по обеспечению систематических и бесперебойных усилий по доставке гуманитарной помощи пострадавшим от стихийных бедствий сообществам.

    Роль PNP в MOA, помимо предоставления вспомогательного склада в различных провинциальных полицейских управлениях, заключается в предоставлении DSWD кадровой помощи в распределении продовольственных и непродовольственных товаров, а также в обеспечении безопасности и обслуживания склада. .

    Тем временем DSWD должен разместить запасы продовольствия и непродовольственных товаров на вспомогательных складах провинциальных полицейских управлений. В соответствии с их мандатом, DSWD несет ответственность за пополнение, увеличение и распределение запасов среди бенефициаров, отслеживает соблюдение требований своих подразделений в провинциях и муниципалитетах, проводит инвентаризацию для отслеживания товаров с почти истекшим сроком годности или испорченных товаров и ежемесячно выплачивать 5000 филиппинских песо в качестве своей доли в счетах за коммунальные услуги на вспомогательных складах.

    «Мы хотели расширить нашу помощь людям любым доступным нам способом, не только путем предоставления услуг безопасности, но и путем открытия наших офисов в качестве вспомогательного склада для DSWD, чтобы гарантировать, что товары, подлежащие распределению среди людей, находятся в хорошее состояние. В конце концов, наша единственная цель — помочь людям и предоставить им самые лучшие общественные услуги, которых они по праву заслуживают », — сказал PBGEN PERALTA.

    На подписании также присутствовали PBGEN ENRIQUE N MAGALONA, заместитель регионального директора по административным вопросам, четыре провинциальных директора PRO1, PCOL RONALD V GAYO, Пангасинанское PPO; PCOL JONATHAN G CALIXTO, La Union PPO; PCOL WILSON L DOROMAL, Ilocos Sur PPO; и PCOL CHRISTOPHER N ABRAHANO, Ilocos Norte PPO, и помощник регионального директора по работе DSWD-RO1, Марлен Фебес Д. Перальта и сотрудник по социальному обеспечению IV, Марисель С. Калеха.###

    Просмотров: 154

    GM-CSF негативно регулирует ранние опосредованные IL-10 ответы

    Abstract

    Воспалительные заболевания становятся все более распространенными в западном мире. Лечение этих заболеваний основано на вмешательстве в воспалительные реакции, тем самым восстанавливая иммунный гомеостаз. Одним из цитокинов, способных восстанавливать иммунный гомеостаз, является противовоспалительный цитокин интерлейкин-10 (IL-10).Но до сих пор лечение ИЛ-10 не было столь успешным, как ожидалось. Причиной этого может быть то, что чувствительность к IL-10 зависит от среды воспаленной ткани. В этом исследовании мы описываем, что гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) является ключевым цитокином, который негативно регулирует опосредованные IL-10 ответы. Дендритные клетки, дифференцированные из костного мозга с помощью GM-CSF, имеют пониженную способность отвечать на IL-10. Дендритные клетки нарушают повышающую регуляцию экспрессии SOCS3, индуцированной IL-10, и неспособны подавлять LPS-индуцированную экспрессию TNF-α в ранний момент времени.Кроме того, обработка GM-CSF частично воспроизводит этот фенотип в макрофагах. Неожиданно оказалось, что GM-CSF регулирует активность IL-10 в макрофагах, не влияя на активацию STAT3. Тем не менее, GM-CSF индуцирует конститутивное фосфорилирование киназы гликогенсинтазы 3β, сигнального компонента ниже пути PI3K / Akt. Знание точного механизма, с помощью которого GM-CSF негативно регулирует активность IL-10, может дать новое понимание интеграции путей передачи сигнала, вызываемых различными цитокинами.В конечном итоге эти знания могут предоставить нам новые терапевтические стратегии для лечения воспалительных заболеваний.

    Введение

    Распространенность воспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника или аллергия, резко возросла за последние пару десятилетий. Эти воспалительные заболевания характеризуются неконтролируемыми иммунными ответами против безвредных антигенов или комменсальных бактерий. Лечение этих заболеваний основано на вмешательстве в воспалительные реакции и, таким образом, на восстановлении иммунного гомеостаза.Многие воспалительные заболевания лечат иммунодепрессантами или моноклональными антителами, которые нацелены на ключевые провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). Однако иммунное вмешательство также можно проводить с помощью противовоспалительных цитокинов. Одним из таких цитокинов, способных восстанавливать гомеостаз, является интерлейкин-10 (ИЛ-10). IL-10 представляет собой противовоспалительный цитокин, который подавляет активность как антигенпрезентирующих клеток, так и лимфоцитов, и считается многообещающим средством лечения некоторых воспалительных заболеваний [1].Однако до сих пор терапия ИЛ-10 не была столь успешной, как предполагалось ранее.

    Системное введение рекомбинантного человеческого IL-10, продуцируемого в Escherichia coli , изучалось в фазе II клинических испытаний для лечения пациентов с болезнью Крона. Но, несмотря на то, что лечение ИЛ-10 хорошо переносится [2], пациенты по-разному реагируют на лечение ИЛ-10 [3]. Было предложено несколько объяснений того, почему лечение ИЛ-10 не было успешным лечением болезни Крона: (1) системное введение не приводит к эффективной дозе в кишечнике; (2) фенотип / тяжесть заболевания вызывают различия в ответе на ИЛ-10; (3) Лечение ИЛ-10 успешно только в качестве профилактического лечения; (4) лечения одним ИЛ-10 недостаточно; или (5) иммуностимулирующие эффекты IL-10 уравновешивают его иммуносупрессивные эффекты [4].Чтобы обойти системное введение IL-10, был сконструирован Lactococcus lactis , секретирующий человеческий IL-10 и использованный в качестве системы пероральной доставки [5]. Эта система локальной доставки IL-10 оказалась успешной на двух моделях кишечного воспаления на мышах [5] и оказалась безопасной в небольшом исследовании I фазы на людях [6]. Однако в 2009 г. была завершена фаза II испытания на людях модифицированного L. lactis у пациентов с язвенным колитом, но не наблюдалось существенной разницы в заживлении слизистой оболочки по сравнению с контролем плацебо (пресс-релиз ActoGeniX).Будущие исследования должны выяснить, действительно ли местная доставка IL-10 является многообещающим терапевтическим подходом.

    Другое объяснение неэффективности ИЛ-10 в качестве терапии может возникать из-за различий между пациентами в зависимости от фенотипа или тяжести заболевания [4]. Например, альвеолярные макрофаги обладают пониженной способностью отвечать на ИЛ-10 во время хронического воспаления [7]. Предварительная обработка этих макрофагов TNF-α снижала их способность отвечать на IL-10, не влияя на экспрессию рецептора IL-10 (IL-10R).Точно так же агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) были способны снижать опосредованное IL-10 фосфорилирование и ядерную транслокацию фактора транскрипции STAT3 в макрофагах и дендритных клетках без снижения поверхностной экспрессии IL-10R [8, 9]. Напротив, экспрессия IL-10R и последующая передача сигналов IL-10R снижались в макрофагах после распознавания зимозана [10] или лигирования рецепторов Fc [11]. Кроме того, было показано, что цитокины, такие как IFN-γ, изменяют опосредованные IL-10 ответы [12].В целом, есть некоторые свидетельства того, что медиаторы воспаления могут влиять на активность IL-10.

    Ранее мы описали, что дендритные клетки костного мозга по-разному реагируют на IL-10 по сравнению с макрофагами [13]. Дендритные клетки обладают пониженной способностью подавлять LPS-индуцированный TNF-α, особенно при оценке раннего IL-10-опосредованного подавления. Отсутствие ранней супрессии TNF-α совпало с нарушенной способностью дендритных клеток повышать экспрессию SOCS3 после обработки IL-10.Поэтому мы продолжили исследовать основной механизм, который объясняет, почему дендритные клетки по-разному реагируют на IL-10, чем макрофаги. В этом исследовании мы описываем, что GM-CSF, цитокин, используемый для дифференциации дендритных клеток, является ключевым фактором, который негативно регулирует опосредованные IL-10 ответы. Мы также показываем, что GM-CSF регулирует активность IL-10, не влияя сильно на активацию STAT3. Напротив, GM-CSF индуцирует конститутивное фосфорилирование GSK-3β, но вопрос о том, является ли это механизмом, с помощью которого GM-CSF контролирует активность IL-10, требует дальнейшего изучения.

    Результаты

    Опосредованная IL-10 передача сигналов в дендритных клетках и макрофагах

    Ранее мы наблюдали клеточно-специфические различия в ответе на IL-10 в макрофагах и дендритных клетках [13]. Дендритные клетки сильно нарушают свою способность подавлять LPS-индуцированный TNF-α после 2 часов стимуляции, тогда как макрофаги уже подавляют экспрессию TNF примерно на 75% (рис. 1a). Поэтому мы исследовали, различается ли передача сигналов IL-10 в этих двух типах клеток. Сначала мы сосредоточились на активации фактора транскрипции STAT3.Как показано на рисунке 1b, IL-10 индуцирует сильное фосфорилирование тирозина STAT3 (Y705) дозозависимым образом в обоих типах клеток. При количественной оценке относительной активации STAT3 мы наблюдали более сильную степень фосфорилирования STAT3 Y705 в макрофагах, чем в дендритных клетках (рис. 1c). Однако это было значительно выше только при дозе 1 нг / мл IL-10. С другой стороны, степень фосфорилирования серина (S727) в макрофагах была значительно выше только при дозе 10 нг / мл (рис. 1d).Тем не менее, при сравнении необработанных клеток с клетками, обработанными IL-10, мы наблюдали только дозозависимое фосфорилирование STAT3 S727 в макрофагах ( P <0,05 для всех концентраций). Необработанные дендритные клетки уже имеют более высокую степень фосфорилирования STAT3 S727 , которая не усиливается обработкой IL-10. Следовательно, сериновое фосфорилирование STAT3 может быть специфичным для клеточного типа.

    Рис. 1 Опосредованная IL-10 передача сигналов в дендритных клетках и макрофагах.

    (a) Макрофаги и дендритные клетки предварительно обрабатывали IL-10 и стимулировали 100 нг / мл LPS, а ингибирование экспрессии TNF-α определяли через 2 и 24 часа ( n = 3, столбцы ошибок представляют стандартная ошибка).(b) Фосфорилирование тирозина 705 (Y705) и серина 727 (S727) из STAT3 с помощью IL-10 (0, 1,10 и 100 нг / мл) анализировали в макрофагах и дендритных клетках с помощью вестерн-блоттинга. (c / d) Относительная индукция фосфорилирования STAT3 была определена количественно для Y705 (c) и S727 (d) при анализе вестерн-блоттинга ( n = 3 или 4 для Y705 и S727 соответственно, полосы ошибок представляют стандартную ошибку). (e) Макрофаги и дендритные клетки обрабатывали 100 нг / мл IL-10 и анализировали активацию внутриклеточных сигнальных путей с помощью PathScan Array.Представительная цифра дана для 2 независимых экспериментов. Звездочка (звезды) указывает на значительные различия, определенные с помощью теста Велча t (* P <0,05; ** P <0,01).

    Затем мы оценили активацию 18 хорошо охарактеризованных сигнальных молекул с помощью набора PathScan Intracellular Signaling Array. На рисунке 1e представлены репрезентативные наборы для макрофагов и дендритных клеток, обработанных 100 нг / мл IL-10, и их соответствующие контрольные среды.Легенда указывает, на какие сигнальные молекулы влияют по-разному. Поразительно, но мы обнаружили фосфорилирование STAT3 Y705 только после обработки IL-10. Интересно, что мы наблюдали различия в активации других сигнальных молекул между необработанными макрофагами и дендритными клетками. Необработанные дендритные клетки, по-видимому, имеют более высокую степень фосфорилированного AMPKα и рибосомного белка S6, которые являются индикаторами прогрессии клеточного цикла и клеточного роста. Кроме того, несколько сигнальных молекул ниже пути PI3K / Akt (PRAS40, Bad и GSK-3β) активируются в необработанных макрофагах и дендритных клетках, но степень фосфорилирования GSK-3β (Ser9) намного выше в дендритных клетках.Фосфорилирование GSK-3β ингибирует его активность и тем самым способствует выживанию клеток. В целом мы заключаем, что STAT3 является основной сигнальной молекулой для IL-10. Кроме того, на макрофаги и дендриты по-разному влияют сигнальные молекулы, которые регулируют рост и выживание клеток.

    GM-CSF отрицательно регулирует активность IL-10

    Дендритные клетки дифференцируются от клеток костного мозга путем их культивирования в присутствии цитокина GM-CSF. Чтобы выяснить, может ли GM-CSF быть ответственным за измененные ответы дендритных клеток на IL-10, мы исследовали, может ли GM-CSF реплицировать этот фенотип в макрофагах.Макрофаги и дендритные клетки были дифференцированы из костного мозга, но теперь GM-CSF был добавлен к макрофагам или истощен из дендритных клеток в течение последних 24 часов культивирования. Затем клетки предварительно обрабатывали IL-10, а затем провоцировали липополисахаридом (LPS). Фигуры 2a-c показывают, что GM-CSF действительно способен изменять ответ макрофагов на IL-10. IL-10 подавляет экспрессию TNF-α в дозозависимом материале в макрофагах независимо от обработки GM-CSF (рис. 2a), но обработка GM-CSF снижает максимальный процент экспрессии TNF-α при более низкой дозе IL-10. .

    Рисунок 2 GM-CSF подавляет ранние опосредованные IL-10 ответы.

    Макрофаги (a-c) и дендритные клетки (d-f) культивировали в течение последних 24 часов в присутствии или отсутствии (+/-) GM-CSF. Клетки предварительно обрабатывали в течение 20 мин. ИЛ-10 с последующей стимуляцией 100 нг / мл ЛПС. Ингибирование экспрессии TNF-α определяли через 24 часа стимуляции (а / д). Альтернативно, клетки предварительно обрабатывали в течение 20 минут 10 нг / мл IL-10, а затем стимулировали 100 нг / мл LPS. Подавление экспрессии TNF-α определяли через 2 часа стимуляции (b / e).Также приведены абсолютные уровни экспрессии TNF-α для вышеупомянутых экспериментов (c / f). Все столбцы представляют собой среднее значение 3-5 биологических повторов ( n = 3-5, столбцы ошибок указывают стандартную ошибку), а звездочка (звезды) указывает на значительные различия, определенные с помощью теста Велча t (* P < 0,05; ** P <0,01).

    Кроме того, обработка макрофагов GM-CSF значительно снижает раннее опосредованное IL-10 подавление TNF-α на ~ 25%. Мы также наблюдали, что макрофаги, обработанные GM-CSF, продуцировали значительно больше TNF-α, чем необработанные макрофаги (рис. 2c).Эти результаты показывают, что GM-CSF способен изменять опосредованные IL-10 ответы в макрофагах, как это наблюдалось для дендритных клеток, дифференцированных с помощью GM-CSF.

    Точно так же истощение дендритных клеток из GM-CSF усиливало их ответ на IL-10. Не наблюдали никаких различий в подавлении экспрессии TNF-α после 24-часовой стимуляции, когда дендритные клетки были истощены из GM-CSF (фиг. 2d). Однако раннее опосредованное IL-10 подавление экспрессии TNF-α значительно увеличилось почти на 25%, когда дендритные клетки были истощены из GM-CSF.Кроме того, продукция TNF-α была значительно снижена, когда дендритные клетки культивировали в отсутствие GM-CSF. Таким образом, мы пришли к выводу, что GM-CSF является ключевым фактором, который модулирует ранние опосредованные IL-10 ответы как в макрофагах, так и в дендритных клетках.

    GM-CSF регулирует активность IL-10, не влияя на активацию STAT3.

    Ранние опосредованные IL-10 ответы, по-видимому, контролируются основным противовоспалительным путем Jak1-STAT3-SOCS3. Чтобы изучить, как GM-CSF влияет на ранние опосредованные IL-10 ответы, мы сначала сосредоточились на активации STAT3.Как показано на фиг. 3а, IL-10 индуцирует сильное фосфорилирование STAT3 Y705 независимо от обработки GM-CSF. Фосфорилирование STAT3 S727 , по-видимому, также не зависело от лечения GM-CSF. GM-CSF, по-видимому, регулирует ранние опосредованные IL-10 ответы, не влияя на активацию STAT3. Однако раннее ингибирование TNF-α с помощью IL-10 полностью отменяется в обработанных GM-CSF макрофагах мышей LysMcre / Stat3flox, у которых отсутствует экспрессия Stat 3 в макрофагах (фиг. S1). Это указывает на то, что STAT3 необходим для ранних опосредованных IL-10 ответов, но что GM-CSF негативно регулирует этот ответ независимым от STAT3 образом.

    Поскольку GM-CSF не влиял на фосфорилирование STAT3, мы продолжали исследовать влияние GM-CSF на индуцированную IL-10 экспрессию SOCS3. Относительные уровни транскрипта SOCS3 определяли количественной ПЦР как в макрофагах, так и в дендритных клетках. Как показано на рисунке 3b, IL-10 индуцирует экспрессию SOCS3 в ~ 100 раз в макрофагах, тогда как повышающая регуляция SOCS3 значительно ниже в дендритных клетках (в 12 раз, P = 0,008). Неожиданно не было обнаружено значительных различий в относительных уровнях экспрессии SOCS3 при обработке IL-10 нормальных макрофагов и макрофагов, обработанных GM-CSF.Однако специфическая индукция IL-10 SOCS3 была снижена примерно в 10 раз. Это связано с тем, что GM-CSF сам по себе уже усиливает экспрессию SOCS3 в макрофагах до лечения IL-10. Истощение GM-CSF из дендритных клеток привело только к 2-кратному увеличению экспрессии SOCS3. Следовательно, GM-CSF, по-видимому, регулирует ранние опосредованные IL-10 ответы не только независимо от STAT3, но также не влияя на уровни экспрессии SOCS3.

    Затем мы оценили, изменяет ли обработка макрофагов GM-CSF передачу сигналов, опосредованную IL-10, или другие пути передачи сигналов с помощью набора PathScan Intracellular Signaling Array.Как мы наблюдали ранее, IL-10 индуцирует фосфорилирование STAT3 Y705 только в макрофагах и дендритных клетках, что не зависит от предварительной обработки GM-CSF. Сам GM-CSF вызывает состояние активации в макрофагах, неотличимое от дендритных клеток. Обработка макрофагов GM-CSF усиливает фосфорилирование AMPKα и рибосомного белка S6, но наиболее сильно индуцирует фосфорилирование GSK-3β. Фосфорилирование других сигнальных молекул ниже PI3K / Akt (PRAS40 и Bad) также усиливается.С другой стороны, истощение дендритных клеток из GM-CSF освобождает PRAS40 от фосфорилирования, тогда как GSK-3β остается сильно фосфорилированным. Таким образом, мы пришли к выводу, что GM-CSF изменяет статус активации сигнальных молекул, которые регулируют клеточный рост и выживание в макрофагах и дендритных клетках.

    Рисунок 3 GM-CSF отрицательно влияет на активность IL-10, не влияя на активацию STAT3.

    (a) Макрофаги обрабатывали GM-CSF в течение 24 часов или оставляли без лечения. Затем клетки активировали IL-10 (0, 1, 10 и 100 нг / мл), и фосфорилирование тирозина 705 (Y705) и серина 727 (S727) STAT3 анализировали с помощью вестерн-блоттинга.(b) Относительные уровни транскрипта SOCS3 анализировали с помощью количественной ПЦР как в макрофагах, так и в дендритных клетках, которые были обработаны GM-CSF в течение ночи или оставлены без обработки ( n = 3, полосы ошибок представляют стандартную ошибку). Кратковременная индукция экспрессии SOCS3 после обработки IL-10 (100 нг / мл) была рассчитана с использованием метода 2 ΔCt с использованием HPRT в качестве контрольного гена и изображена над столбиками на графике (макрофаги / дендритные клетки). (c) Макрофаги и дендритные клетки обрабатывали в течение ночи GM-CSF или оставляли без обработки.Затем клетки стимулировали 100 нг / мл IL-10 и анализировали активацию внутриклеточных сигнальных путей с помощью PathScan Array. Представительная цифра дана для 2 независимых экспериментов. Звездочка (звезды) указывает на значительные различия, определенные с помощью теста Велча t (* P <0,05; ** P <0,01).

    Обсуждение

    Интерлейкин-10 (ИЛ-10) представляет собой противовоспалительный цитокин с многообещающим терапевтическим потенциалом, но на сегодняшний день терапия ИЛ-10 не была столь успешной в клинике, как предполагалось ранее.Вероятное объяснение этого феномена состоит в том, что на активность IL-10 влияет цитокиновая среда, присутствующая в воспаленных тканях [10–12]. Ранее мы описали дифференциальный ответ макрофагов и дендритных клеток на IL-10 [13]. Дендритные клетки неспособны быстро реагировать на IL-10, поскольку они неспособны подавлять LPS-индуцированный TNF-α на ранних стадиях. Более того, индуцированная IL-10 экспрессия SOCS3 была сильно снижена по сравнению с макрофагами. В этом исследовании мы дополнительно исследовали механизм, который контролирует этот дифференциальный ответ между макрофагами и дендритными клетками.Наше исследование демонстрирует, что цитокин GM-CSF, цитокин, используемый для дифференциации дендритных клеток, является ключевым фактором, отрицательно регулирующим активность IL-10. Предварительная обработка GM-CSF макрофагов, полученных из костного мозга, также снижает их способность подавлять LPS-индуцированный TNF-α через 2 часа после стимуляции. Напротив, истощение дендритных клеток из GM-CSF частично восстановило их ранний ответ на IL-10. Кроме того, как макрофаги, так и дендритные клетки, культивируемые в присутствии GM-CSF, продуцировали значительно более высокие уровни TNF-α, что совпало с предыдущими сообщениями Fleetwood с соавторами [14, 15].Повышенные уровни экспрессии TNF-α при стимуляции LPS вызваны увеличением базальных уровней транскрипта мРНК TNF-α после обработки GM-CSF [15]. В нашем исследовании макрофаги и дендритные клетки, обработанные GM-CSF, не продуцируют существенно разные уровни TNF-α, тогда как оба типа клеток по-разному реагируют на IL-10. Различия в базовых уровнях экспрессии TNF-α не могут объяснить наблюдаемый дифференциальный ответ на IL-10. Поэтому мы продолжили исследовать опосредованную IL-10 передачу сигналов в макрофагах и дендритных клетках.

    Взаимодействие с рецептором IL-10 приводит к активации нижележащих janus киназ Jak1 и Tyk2, которые, в свою очередь, фосфорилируют транскрипционные факторы STAT1, STAT3 и в некоторых типах клеток STAT5 [16–18]. IL-10 хорошо известен своей способностью активировать путь Jak-STAT [19], но также описаны альтернативные пути передачи сигналов. В частности, IL-10-опосредованная активация сигнального пути PI3K участвует в свойствах IL-10, способствующих выживанию [20, 21]. Zhou и соавторы также обнаружили, что IL-10 индуцирует активацию киназы, связанной с внеклеточными сигналами [22] 1/2, PI3K-зависимым образом в промиелоидных клетках [21].Кроме того, было показано, что IL-10 активирует передачу сигналов p38 MAPK, чтобы индуцировать экспрессию гемоксигеназы-1 [23]. В нашем исследовании мы смогли обнаружить только опосредованную IL-10 активацию фактора транскрипции STAT3 в макрофагах и дендритных клетках костного мозга. Это указывает на то, что STAT3 является основным фактором транскрипции, необходимым для опосредованных IL-10 ответов в клетках костного мозга. Однако мы действительно наблюдали тонкие различия в фосфорилировании STAT3 Y705 между обычными макрофагами и дендритными клетками.Более поразительным было наблюдение, что IL-10 не был способен индуцировать фосфорилирование STAT3 S727 дозозависимым образом в дендритных клетках. Ранее сообщалось о фосфорилировании серина STAT3 для IL-6, IL-22, IFN-y и EGF [24–27], и оно усиливает транскрипционную активность STAT3. Отсутствие фосфорилирования STAT3 S727 может объяснить, почему индуцированная IL-10 экспрессия SOCS3 и раннее ингибирование экспрессии TNF-α нарушены в дендритных клетках.

    Qasimi и др. Ранее описали, что SOCS3 требуется IL-10 для подавления экспрессии TNF-α в ранние моменты времени стимуляции [28].Поэтому мы исследовали роль SOCS3 более подробно. Мы наблюдали снижение способности макрофагов быстро реагировать на IL-10 после обработки GM-CSF, но это, по-видимому, не зависело от усиления экспрессии SOCS3. На относительную индукцию экспрессии SOCS3 с помощью IL-10 практически не влияла обработка макрофагов GM-CSF в течение ночи или истощение дендритных клеток из GM-CSF. Это контрастирует с различием в индуцированной IL-10 экспрессии SOCS3 между обычными макрофагами и дендритными клетками.Кроме того, мы также не наблюдали разницы в фосфорилировании STAT3 Y705 и STAT3 S727 между обычными макрофагами или макрофагами, обработанными GM-CSF. Следовательно, GM-CSF, по-видимому, негативно регулирует ранние опосредованные IL-10 ответы в макрофагах независимо от индуцированной STAT3 экспрессии SOCS3.

    Интересно, что мы действительно обнаружили существенные различия в статусе активации сигнальных молекул ниже передачи сигналов PI3K / Akt в макрофагах и дендритных клетках.Кроме того, GM-CSF индуцировал состояние активации в макрофагах, которое было неотличимо от дендритных клеток. В частности, сильное фосфорилирование серина GSK-3β S9 было поразительным наблюдением в культивируемых GM-CSF дендритных клетках или обработанных GM-CSF макрофагах. Степень фосфорилирования GSK-3β S9 также, по-видимому, обратно коррелирует с ранними IL-10-опосредованными ответами. Более высокая степень фосфорилирования GSK-3β S9 приводит к уменьшенному подавлению LPS-индуцированной экспрессии TNF-α с помощью IL-10.Поскольку IL-10 также способен запускать сигнальный путь PI3K, большой интерес представляет изучение того, как эти сигнальные пути IL-10 и GM-CSF интегрируются и приводят к нарушенным ответам, опосредованным IL-10.

    Активация STAT3 регулируется разнообразным набором посттрансляционных модификаций, включая фосфорилирование, ацетилирование и метилирование [26, 27, 29–34]. Каждая модификация играет свою роль в регулировании оптимальной димеризации STAT3, активности связывания ДНК и транскрипционной активности [35].Об участии сигнального пути PI3K в активации STAT3 также сообщалось ранее. Спенсер и соавторы обнаружили, что цитомегаловирусный гомолог IL-10 был способен индуцировать фосфорилирование серина STAT3 S727 PI3K-зависимым образом [36]. Кроме того, было показано, что ацетилирование STAT3 L685 с помощью IL-6 зависит от активации PI3K / Akt [37]. Однако, требует ли IL-10-индуцированная активация транскрипции STAT3 ацетилирования и / или метилирования и участвует ли путь PI3K, нуждается в дальнейших исследованиях.Интересно, что Вайткус с соавторами недавно сообщили о новом механизме активации STAT3, который опосредуется GSK-3α / β [35]. Было показано, что GSK-3α / β непосредственно фосфорилирует STAT3 по остаткам S727 и T714. Поэтому потребность в GSK-3α / β для индуцированной IL-10 активации STAT3 представляет большой интерес, поскольку это исследование показывает, что GM-CSF сильно ингибирует GSK-3β путем фосфорилирования остатка серина 9. Следовательно, GSK-3α / β может быть ключевой сигнальный узел, который способен контролировать опосредованные IL-10 ответы.

    Ранее Харт и его сотрудники уже сообщали, что IL-10 неспособен подавлять экспрессию MHC-II в моноцитах, культивируемых с помощью GM-CSF [38]. Наше исследование теперь также демонстрирует, что GM-CSF способен изменять опосредованное IL-10 подавление экспрессии TNF-α как в макрофагах, так и в дендритных клетках. Кроме того, мы и другие показали, что культивируемые GM-CSF клетки продуцируют значительно более высокие уровни провоспалительного цитокина TNF-α [15], но также секреция IL-12p70 и IL-23 значительно усиливается макрофагами, обработанными GM-CSF. [15].IL-23 недавно был идентифицирован как важный провоспалительный цитокин, управляющий как врожденным, так и индуцированным Т-клетками воспалением кишечника [39]. Следовательно, GM-CSF, по-видимому, индуцирует цитокиновую среду, благоприятную для хронического воспаления. За последние пару лет GM-CSF был определен как ключевой фактор развития хронического воспаления на животных моделях воспаления кишечника, рассеянного склероза и ревматоидного артрита [40–42]. Объединение ключевой роли GM-CSF в развитии хронического воспаления с результатами, полученными в этом исследовании, может объяснить, почему терапия IL-10 не была столь эффективной, как предполагалось ранее.Наше исследование демонстрирует, что провоспалительный цитокин GM-CSF способен негативно регулировать опосредованные IL-10 ответы в макрофагах и дендритных клетках. Однако будущие исследования должны выяснить точный механизм того, как пути передачи сигналов GM-CSF и IL-10 интегрированы и приводят к нарушенным клеточным ответам на IL-10. В конечном итоге эти знания могут предоставить нам новые терапевтические стратегии для лечения воспалительных заболеваний.

    Экспериментальные процедуры

    Мыши

    Мышей C57BL / 6J дикого типа разводили и содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, в помещениях для животных в Университете Вагенингена.Все эксперименты были одобрены и проведены в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами учреждения по уходу за животными в Университете Вагенингена. Эксперименты этого конкретного исследования были одобрены комитетом по экспериментам на животных (DEC) Wageningen University & Research.

    Культуры костного мозга

    Костный мозг выделяли из бедренной и большеберцовой кости мышей C57BL / 6J в возрасте 6–12 недель. Макрофаги, происходящие из костного мозга (BMMΦ), были дифференцированы при 37 ° C / 5% CO 2 в среде RPMI-1640, содержащей 4 мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES и дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 50 мкМ β- меркаптоэтанол, 50 Ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина и 20% отработанная среда из клеток L929 (АТСС).Клетки костного мозга высевали из расчета 1 × 10 6 клеток / мл в 6- или 96-луночные планшеты для тканевых культур и культивировали в течение 6 дней, при обновлении среды на 3 день. После 6 дней культивирования ≥95% клеток экспрессировалось. маркеры макрофагов F4 / 80 и CD11b.

    Дендритные клетки, полученные из костного мозга (BMDC), дифференцировали в течение 10 дней, как описано [43], с использованием 10% отработанной среды из клеток X63, трансфицированных GM-CSF мыши [44]. Клетки X63-GM-CSF были любезно предоставлены доктором. М. Лутц (Университет Эрлангена-Нюрнберга) с одобрения д-ра.Б. Стокингер (Национальный институт медицинских исследований MRC). Вкратце, клетки костного мозга высевали из расчета 2 × 10 5 клеток / мл в бактериологические чашки Петри и инкубировали при 37 ° C / 5% CO 2 . На 3, 6 и 8 день обновляли среду, а на 10 день собирали как прикрепленные, так и неприлипающие клетки. В это время обычно ~ 90% клеток экспрессировали маркеры дендритных клеток CD11c и MHC класса II.

    Проточная цитометрия

    Клетки, полученные из костного мозга, окрашивали в буфере FACS (PBS, содержащий 0.1% БСА и 5 мМ ЭДТА) с использованием следующих моноклональных антител для маркеров клеточной поверхности (все получены от eBioscience): PE-конъюгированный анти-CD11b, APC-конъюгированный анти-F4 / 80, PE-конъюгированный анти-CD11c, APC-конъюгированный MHC -II. Клетки сначала инкубировали с блоком рецептора Fc (eBioscience) в течение 10 минут, чтобы заблокировать любое неспецифическое связывание, и последующие этапы окрашивания выполняли в течение 20 минут. при 4 ° C с последующей промывкой буфером FACS. Окрашенные клетки собирали с помощью анализатора Cyan-ADP (Beckman Coulter) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.).

    Анализы стимуляции LPS

    BMMΦ были дифференцированы в 96-луночные планшеты, и BMDC были засеяны в 96-луночные планшеты при плотности 5 × 10 4 / лунку. Клетки предварительно обрабатывали в течение 15 мин. с ИЛ-10 и затем стимулировали липополисахаридом (ЛПС) 100 нг / мл. После 2-часовой или ночной стимуляции супернатанты анализировали на TNF-α с помощью Ready-Set-Go! ® ELISA kit (eBioscience) согласно протоколу поставщика.

    IL-10 индуцированная передача сигналов

    Клетки, полученные из костного мозга, обрабатывали в течение 20 мин.с ИЛ-10 (0, 1, 10 или 100 нг / мл). Клетки лизировали с использованием 1x буфера для лизиса клеток (Cell Signaling Technology), и общее содержание растворимого белка в лизатах определяли методом BCA (Pierce). Белки разделяли на 12% -ном бис-трис-геле с последующим переносом на PVDF-мембрану с помощью процедуры влажного блоттинга. После этого мембрану блокировали в PBS (содержащем 0,1% об. / Об. Твин-20 и 5% мас. / Об. Обезжиренного сухого молока) в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией в течение ночи при 4 ° C с моноклональными антителами, специфичными для STAT3, фосфо-STAT3 Y705 или фосфо-STAT3 S727 в PBS (содержащий 0.1% об. / Об. Твина-20 и 1% мас. / Об. BSA). Все антитела к STAT3 были получены от Cell Signaling Technology. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированный с HRP ослиный антикроличий IgG (Jackson ImmunoResearch). Интенсивность полос анализировали с помощью программного обеспечения Image J Software.

    Клеточные лизаты также использовали для исследования активации 18 хорошо охарактеризованных сигнальных молекул с использованием набора PathScan Intracellular Signaling Array (Cell Signaling Technology) в соответствии с протоколом производителя. Блоты и массивы визуализировали в системе G: BOX Chemi (Syngene).

    Количественная ПЦР

    BMMΦ были дифференцированы в 6-луночные планшеты и 3 × 10 6 BMDC были засеяны в 6-луночные планшеты и обработаны в течение 2 часов IL-10 (0, 1, 10 или 100 нг. / мл). Затем клетки промывали PBS и мРНК выделяли с помощью набора Maxwell ® 16 Tissue LEV Total RNA Purification Kit и прибора Maxwell ® 16 (оба от Promega). Затем кДНК была синтезирована с использованием GoScript TM — системы обратной транскрипции (Promega) в соответствии с протоколом поставщика.Образцы анализировали в трех повторностях на экспрессию SOCS3 и HPRT (контрольный ген) с помощью количественной ПЦР с использованием смеси ABsolute SYBR Green Fluorescein (Thermo Scientific). Кратковременную индукцию экспрессии SOCS3 определяли методом Пфаффла [45].

    Анализ данных

    Все данные, показанные на рисунках, указывают на среднее значение по крайней мере трех биологических повторов ( n ), которые были определены с помощью трех технических повторов. В подписях к рисункам указано n , а полосы ошибок указывают стандартную ошибку.Достоверные различия между выборками были рассчитаны с использованием t-критерия Стьюдента и считались значимыми при P <0,05. Существенные различия обозначены на рисунках звездочками ( P <0,05 (*) или P <0,01 (**)).

    Андхра-Прадеш

    Во время визита в Кашмир члены Европейского парламента (депутаты Европарламента) в среду признали, что проблемы в регионе связаны с терроризмом, и заявили, что он не должен «превращаться в Сирию или другой Афганистан», охваченный анархией и повсеместным насилием.Источники сообщили в среду, что ожидается разрешение тупика BJP-Shiv Sena по поводу формирования правительства в Махараштре, и новое постановление может вступить в должность до истечения срока исходящей ассамблеи 9 ноября, сообщили в среду источники. Д.К. Шивакумар по личному залогу в размере 25000 рупий в связи с делом об отмывании денег. Чтобы отговорить людей от взлома взломщиков, правительство Дели организует мега-лазерное шоу Дивали с 26 по 29 октября на Коннот-плейс, объявил в субботу главный министр Арвинд Кеджривал. .

    PAK की नई चाल, करतारपुर कॉरिडोर उद्घाटन के लिए मनमोहन

    Правительство Камал Натха в Мадхья-Прадеше расстелило красную ковровую дорожку для промышленников, особенно для тех, кто интересуется переработкой продуктов питания, логистикой, искусственным интеллектом и нанотехнологиями, поскольку в пятницу здесь проходит мега-инвестиционный саммит. Немного был Шакти Сиддхешвар Рана, которой сейчас 62 и охранник в бунгало Салмана Хана, могли бы предположить, что его поймают за преступление, которое он совершил более двух десятилетий назад Совет Безопасности ООН не будет обсуждать вопрос Кашмира в этом месяце, Карен Пирс, Постоянный представитель США Представитель Королевства ООН и председатель Совета Безопасности в ноябре заявили, что в воскресенье в своей резиденции в районе Джалгаон в Махарастре трое вооруженных лиц застрелили корпорацию BJP и четверо членов его семьи, сообщила полиция.Министр обороны Раджнат Сингх отправится с двухдневным визитом во Францию ​​с понедельника, во время которого он проведет ежегодный диалог по вопросам обороны с министром вооруженных сил Франции Флоренс Парли, говорится в заявлении министерства обороны. «Ущерб мечети в 1934 году, ее осквернение в 1949 году, приведшее к изгнанию мусульман и последующему разрушению 6 декабря 1992 года, является серьезным нарушением верховенства закона «, — говорится в приговоре. предстоящий приговор суда по вопросу Рам Джанамбхуми.Веб-сайт подразделения BJP в Дели в субботу был взломан подозреваемыми пакистанскими хакерами, которые испортили страницу и опубликовали оскорбительные выражения в адрес премьер-министра Нарендры Моди. Это новый поворот в политической драме, разыгранной партией Bharatiya Janata Party (BJP) и Shiv Сена в Махараштре, Санджай Раут, член парламента Сена и ближайший помощник Уддхава Такри, встретились с супремо Шарадом Паваром Партии националистического конгресса (ПНК).

    Избирательная комиссия Индии намерена объявить даты выборов в ассамблеи Махараштры и Харьяны на пресс-конференции сегодня в 12 часов дня. Протесты продолжались в предрассветные часы субботы, когда власти начали вырубать деревья в колонии Аари в Мумбаи для навеса метро, ​​всего за несколько часов. После того, как Верховный суд Бомбея отклонил все петиции против этого шага, советник по национальной безопасности Аджит Доваль прибыл сюда в среду, чтобы оценить ситуацию в Кашмирской долине и определить дальнейший курс действий для беспрепятственной реализации планов правительства после отмены особого статуса Джамму и Кашмир, заявили официальные лица.Индия и Пакистан в четверг подписали соглашение о вводе в действие Картарпурского коридора, несмотря на то, что щекотливый вопрос о плате за обслуживание в размере 20 долларов, наложенной Исламабадом, оставался нерешенным. Закон о транспортных средствах с внесенными в него поправками, который вводит более высокие штрафы за вождение с 1 сентября, может вызвать дополнительные проблемы для Дели. Пассажиры пригородных поездов во время реализации схемы нечет-четность, поскольку любое нарушение схемы нормирования дорог может стоить людям 20 000 рупий по сравнению с 2 000 рупий ранее. Премьер-министр Нарендра Моди во вторник открыл нефтепровод Мотихари-Амлехгандж (Непал) с помощью видеоконференцсвязи .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *