Гку мади: Московская административная дорожная инспекция / Госуслуги Москвы

Содержание

Московская административная дорожная инспекция / Госуслуги Москвы

Общая информация о ведомстве

Руководитель организации:Григорян Рудик Ашхарабекович

Веб-сайт:http://www.mos.ru/madi/

Электронная почта:[email protected]

Справочный телефон7 (495) 540-76-56

Режим работыпн-чт: с 8:00 до 17:00

пт: с 8:00 до 15:45

обед: с 12:00 до 13:00

Подчинение органу власти:Правительство Москвы

Услуги по ведомству

Ведомством не оказываются государственные услуги

Функции ведомства

Места обращения

Наименование

Адрес

Телефон

Режим работы

Московская административная дорожная инспекция

Телефон

7(495) 540-76-56

Подведомственные организации

У ведомства отсутствуют подведомственные организации, оказывающие госуслуги

Общая информация о ведомстве

Руководитель организации:Григорян Рудик Ашхарабекович

Веб-сайт:http://www. mos.ru/madi/

Электронная почта:[email protected]

Справочный телефон7 (495) 540-76-56

Режим работыпн-чт: с 8:00 до 17:00

пт: с 8:00 до 15:45

обед: с 12:00 до 13:00

Подчинение органу власти:Правительство Москвы

Контактные лица

Информация в данном разделе не заполнена ответственным ведомством

Кафедра «Автомобильные перевозки» | Практика

Наименование программы (бакалавриата, специалитета, магистратуры)

Шифр учебной группы

Вид практики

Сроки практики

Начало практики

Конец практики

1. Очная форма обучения

1.1

Организация перевозок и управление на автомобильном транспорте (230301)

 

1бОП

Учебная

02.07.2021

15.07.2021

2бОП

Производственная

21.06.2021

17.07.2021

3бОП

Производственная

05.07.2021

17.07.2021

4бОП

Преддипломная

11.05.2021

24.05.2021

1.2

Организация перевозок и управление на автомобильном транспорте (230401)

1мАП

Учебная
Производственная

30.12.2020
14.04.2021

20.01.2021
24.07.2021

2мАП

Производственная
НИР
НИР
Производственная
Преддипломная

25.11.2020
23.12.2020
13.01.2021
12.04.2021
27.05.2021

22.12.2020
30.12.2020
01.02.2021
26.05.2021
09.06.2021

1.3

Транспортное планирование (230401)

1мТП

Учебная
Производственная

09.01.2021
12.04.2021

22.01.2021
22.07.2021

2мТП

Учебная
НИР
НИР
Учебная
Преддипломная

25.11.2020
23.12.2020
13.01.2021
14.04.2021
29.05.2021

22.12.2020
31.12.2020
30.01.2021
28.05.2021
11.06.2021

Инспекторов МАДИ научат самообороне :: Autonews

Инспекторов МАДИ научат самообороне

Сотрудников Московской административной дорожной инспекции (МАДИ) отправили на курсы физической подготовки с элементами самообороны, сообщает «M24». Как объяснил замруководителя МАДИ Андрей Сидоров, на улице иногда возникают ситуации, в которых инспекторам нужно уметь постоять за себя поэтому такие тренировки становятся необходимостью.

Кроме этого, со следующего года представителей МАДИ вместе с сотрудниками ГКУ «Администратор московского парковочного пространства», обслуживающих систему платной эвакуации в городе, обучат этике и работе в конфликтных ситуациях. Для этого работников служб отправят на специальные курсы.

Обучение будет состоять из двух программ — «Этика и вежливость общения» и «Работа в конфликтных ситуациях». На уроках по этике и вежливости слушателям расскажут о культуре речи, речевых формулах общения, объяснят, как нужно приветствовать собеседника, какую мимику и жесты лучше всего использовать. Кроме того, сотрудники МАДИ и АМПП узнают, каких фраз стоит избегать во время общения, как корректно вести спор и участвовать в переговорах.

Во втором курсе, «Работа в конфликтных ситуациях», слушателям расскажут, как построить диалог с агрессивно настроенным собеседником, как правильно отвечать на оскорбительные фразы и «нападки». Кроме того, сотрудники АМПП и МАДИ узнают об эффективных способах защиты от агрессии, негатива и провокаций, а также о том, как можно быстро успокоиться и прийти в форму, в том числе с помощью приемов психической само- и взаимопомощи.

Напомним, Московская административная дорожная инспекция была создана в Москве 1 ноября 2013 года. Пешие инспекторы МАДИ выписывают штрафы за парковку под знаками 3.27 «Остановка запрещена» и 3.28 «Стоянка запрещена». Кроме того, в Москве работают 70 пеших инспекторов ГКУ «Администратор московского парковочного пространства» (АМПП), они фиксируют только неоплату парковки.

Первые 10 пеших инспекторов МАДИ вышли на службу в феврале этого года. Сообщалось, что в итоге их будет 500 человек. Однако, как пояснили позже, 500 — это общее число сотрудников организации, а пеших инспекторов будет 200.

Фото: Anton Belitsky / Russian Look

Про оплату штрафов (Госавтоинспекция, МАДИ, АМПП и другие)

Прежде чем направить обращение, рекомендуем внимательно ознакомиться со следующей информацией.

Кодексом Российской Федерации об административных правонарушениях (статья 32.2) установлено, что организация

, осуществляющая прием платежей, обязана незамедлительно после уплаты административного штрафа направлять информацию о уплате в Государственную информационную систему о государственных и муниципальных платежах (ГИС ГМП).

Бюджетным кодексом Российской Федерации (статья 160.1) установлено, что администраторы доходов бюджетов бюджетной системы Российской Федерации предоставляют информацию, необходимую для уплаты, в ГИС ГМП.

Федеральное казначейство выполняет функции оператора ГИС ГМП и не уполномочено на внесение изменений в информацию, содержащуюся в ГИС ГМП.

В случае, когда штраф оплачен

Документы, являющиеся основанием для оплаты административного штрафа (протокол об административном правонарушении, постановление по делу об административном правонарушении, квитанция на оплату административного штрафа) содержат уникальный идентификатор начисления (УИН), который необходимо указывать при уплате

.

Для организаций, осуществляющих прием платежей, установлена обязанность по незамедлительной передаче информации об уплате административного штрафа в Государственную информационную систему о государственных и муниципальных платежах (ГИС ГМП).

Если оплаченный штраф отражается на информационных ресурсах как неоплаченный, это означает что:

  • организация, осуществляющая прием платежей, не передала информацию в ГИС ГМП

или

  • организация, осуществляющая прием платежей передала информацию в ГИС ГМП без указания УИН

В таком случае, для направления или уточнения информации об уплате административного штрафа в ГИС ГМП следует обращаться в организацию, принявшую платеж.

В случае, когда штраф отменен

В случае если, постановление по делу об административном правонарушении отменено, но на информационных ресурсах административный штраф продолжает отражаться, это означает, что информация о его отмене в Государственной информационной системе о государственных и муниципальных платежах (ГИС ГМП) отсутствует.

Для администраторов доходов, в том числе Госавтоинспекции, Московской административной дорожной инспекции (МАДИ), Администратора московского парковочного пространства (АМПП) и других, установлена обязанность по передаче информации об отмене административных штрафов в ГИС ГМП.

В случае, если штраф продолжает отражаться на информационном ресурсе, для передачи информации об аннулировании (отмене) административного штрафа в ГИС ГМП, следует обращаться к соответствующему администратору доходов, вынесшему решение об отмене постановления.

Иные случаи

В случае, если Вы повторно оплатили административный штраф, Вам следует обратиться к соответствующему администратору доходов (Госавтоинспекция, Московская административная дорожная инспекция (МАДИ), Администратор московского парковочного пространства (АМПП) или другому), вынесшему постановление по делу об административном правонарушении, с заявлением о возврате излишне уплаченных денежных средств.

В случае, если на информационном ресурсе отражается административный штраф, при этом постановление по делу об административном правонарушении Вы не получили и у Вас отсутствует информация о времени и месте правонарушения, следует обращаться к соответствующему администратору доходов для уточнения оснований вынесения постановления.

Администратора доходов, к которому следует обращаться, можно определить по первым цифрам уникального идентификатора начисления (УИН):

  • 188 – Госавтоинспекция – gibdd.ru
  • 780 или 03554310 – АМПП – ampp.mos.ru
  • 782 или 03560430 – МАДИ – madi.mos.ru

Обращение в связи с действиями МАДИ

Публикуем очередное обращение в связи с действиями МАДИ.

История публикаций по данному вопросу:

Текст обращения:

Прошу защиты моих конституционных прав от произвола чиновников правительства Москвы! На протяжении нескольких месяцев руководство ГКУ «Организатор перевозок» и Московской административной дорожной инспекции (МАДИ) при поддержке руководителя департамента развития транспортной инфраструктуры правительства Москвы, превышая и злоупотребляя должностными полномочиями, сводят со мной счеты путём незаконного назначения административных штрафов. Кроме того, г-жа Овчинникова в своём официально направленном мне ответе помимо оправданий фактов злоупотреблений властью руководством МАДИ и ГКУ «Организатор перевозок», указала сведения, обладающие признаками клеветы.

Так, в официально направленном мне документе от 07.07.2021 за подписью г-жи Овчинниковой содержалась информация о том, что руководство ГКУ «Организатор перевозок»  и МАДИ правомерно используют для собирания доказательной базы статью 26.10 КоАП РФ (якобы применение этой статьи не ограничено по кругу лиц). Данный факт является, с моей точки зрения, умышленным покрывательством противоправной деятельности руководства ГКУ «Организатор перевозок» и МАДИ. В своих обращениях я неоднократно указывал на недопустимость использования данной нормы в отношении физических лиц с указанием Постановления Конституционного Суда РФ, указывающего на противоречие Конституции РФ фактов использования данной статьи в отношении граждан, не являющихся должностными лицами.

Руководство МАДИ и ГКУ «Организатор перевозок» правительства Москвы, превышая и злоупотребляя должностными полномочиями, сводят со мной счеты путём слежки за мной и моим близкими родственниками путём использования камер городского наружного наблюдения. Вторгаются в мою частную жизнь и частную жизнь моих близких родственников, использующих транспортные средства, оформленные на моё имя. Так, сотрудники ГКУ «Организатор перевозок» правительства Москвы доносят своему руководству, какие предметы находятся внутри моих транспортных средств. Также осуществляют фиксацию системами наблюдения без согласия частных лиц фактов посадки в частное транспортное средство и слежку за дальнейшим передвижением этого транспортного средства. Об этих фактах г-жа Овчинникова, не стесняясь, указывает в своём официально направленном мне ответе, при этом утверждает, что сотрудники ГКУ «Организатор перевозок» правительства Москвы не осуществляют мероприятия, обладающие признаками оперативно-розыскных. Здесь, по моему мнению, вопиющий факт вторжения в частную жизнь со стороны чиновников правительства Москвы без согласия граждан и соответствующих на то полномочий!

Ввиду изложенного выше требую провести проверку противоправной деятельности руководства ГКУ «Организатор перевозок» и МАДИ. В отношении Овчинниковой провести дополнительную проверку ещё и на признаки клеветы в официально направленном мне ответе. Выявить виновных должностных лиц и привлечь их к ответственности вплоть до уголовной.

Как проверить, есть ли у вас штраф — Mafin Media

Нередко бывает так, что водители даже не подозревают о наличии у них штрафов. Извещения о нарушениях не всегда доходят по почте своевременно (если вообще доходят). А просроченные штрафы иногда выливаются в серьезные проблемы. Как узнать, есть ли у вас непогашенные долги, читайте в гайде Mafin Media.

Где можно узнать о наличии штрафов

Наиболее универсальные способы — проверить наличие штрафов на портале Госуслуг, сервисе «Автокод» или отправив сообщение на номер 7377 с текстом: «штраф СерияНомерСТС» («штраф 77ав111111») или «штраф СерияНомерВодительскогоУдостовере­ния» («штраф 5500111111»).

Если вы живете в Москве, узнать о наличии административных правонарушений (например, за неправильную парковку) перед ГИБДД, Московской административной дорожной инспекцией (МАДИ) или ГКУ «Администратор Московского парковочного пространства» (АМПП) можно также с помощью официального сайта мэра и правительства Москвы.

Как оплатить штраф

Погасить штраф можно на сайте Госуслуг, официальном сайте мэра и правительства Москвы (для жителей столицы) или в банке — как офлайн, так и онлайн. Все необходимые реквизиты для оплаты вы найдете в копии постановления о правонарушении.

Стоит отметить, что в течение 20 дней после вынесения постановления вы можете оплатить штраф со скидкой 50%. Однако имейте в виду, что это распространяется не на все виды штрафов.

А что делать в случае несогласия со штрафом? Где и как его обжаловать?

На обжалование штрафа дается 10 суток. Срок начинается с момента получения (по почте или лично) копии постановления о нарушении.

При определенных условиях опротестовать штраф можно и позднее. Правда, в таком случае вместе с жалобой вам нужно будет попросить о продлении срока подачи апелляции, объяснить причины задержки и надеяться, что их посчитают достаточно уважительными.

Обжаловать штраф нужно в том ведомстве, которое выписало постановление. Это может быть ГИБДД, районный суд, МАДИ или АМПП. Подробнее о том, как подать апелляцию на штраф, читайте в другом нашем материале.

Ученые КГАСУ приняли участие в Международной конференции «Строительство качественных и безопасных дорог с применением цементобетона и минеральных вяжущих»

Ученые КГАСУ приняли участие в Международной конференции «Строительство качественных и безопасных дорог с применением цементобетона и минеральных вяжущих»

30 сентября 2021 года в Московском автомобильно-дорожном государственном техническом университете (МАДИ) состоялась I Международная научно-практическая конференция «Строительство качественных и безопасных дорог с применением цементобетона и минеральных вяжущих».

Конференция собрала более 300 российских и зарубежных (США, Германия, Беларусь) участников: руководителей транспортного комплекса РФ, представителей органов государственной власти, научного и экспертного сообщества, отраслевых компаний и ассоциаций. Прямая трансляция конференции была организована при поддержке РБК медиахолдинг.

В работе конференции принимали участие министр транспорта и дорожного хозяйства Республики Татарстан Ф.М. Ханифов, заместитель технического директора ГКУ  «Главтатдортранс» Т.Р. Башаров, начальник технического отдела ГКУ «Главтатдортранс» Р.И. Гарифуллин, директор ООО «ТМ Челныпроект» К.В. Белага, а также более 50 представителей республиканских научно-образовательных, проектных и подрядных организаций по онлайн трансляции.

От КГАСУ в работе конференции на площадке МАДИ приняли участие проректор по научно-исследовательской деятельности, заведующий кафедрой автомобильных дорог, мостов и тоннелей Е.А. Вдовин, заведующий кафедрой технологии строительных материалов, изделий и конструкций В.Г. Хозин.

На открытии конференции с приветственным словом выступили: исполняющий обязанности ректора МАДИ Д.Б. Ефименко, руководитель Федерального дорожного агентства Р.В. Новиков, президент Ассоциации бетонных дорог, заведующий кафедрой «Строительство и эксплуатация дорог» МАДИ В.В. Ушаков и другие официальные лица.

С докладом «Применение минеральных вяжущих при строительстве автомобильных дорог Республики Татарстан» выступил проректор по научно-исследовательской деятельности, заведующий кафедрой автомобильных дорог, мостов и тоннелей КГАСУ Е.А. Вдовин.

В завершение мероприятия была принята резолюция об объединении усилий государственных органов власти, бизнес-структур, научных и научно-образовательных организаций для развития сети качественных безопасных автодорог на современном техническом уровне, в том числе с цементобетонным покрытием и применением укрепленных материалов.

Подробнее о конференции:
https://rosavtodor.gov.ru/press-center/news/467841
https://mindortrans.tatarstan.ru/index.htm/news/2016996.htm
https://www.madi.ru/5840-mezhdunarodnaya-nauchno-prakticheskaya-konferenciya-stroitel.html
https://bc.rbc.ru/event/613a310d9a794702d3041803

Фото Пресс-службы Министерства транспорта и дорожного хозяйства РТ, МАДИ, КГАСУ.

Информация предоставлена
Управлением научно-исследовательской деятельности


Аарон и Мади в Мультивселенной. Побочная история №1: Сабрина. Анимационный сериал

. Мади провела меня по лестнице в комнату под подвалом. Я никогда не знал, что комната вообще может существовать. «Так почему мы снова здесь?» — спросила я Мади, когда она зажгла единственный свет. «Я что-то ищу», — сказала она. «И вы взяли меня с собой, потому что?» — спросила я, приподняв бровь.

«Вы хотели знать всех комнат, а это шахты». меня. «Туш.«Сказал я, следуя за ней.» Ага, вот оно. Я забыл, что он там был. — Сказала Мади, показывая что-то. «Что это?» — спросила я, скрещивая руки на груди. «Ситхский голокрон моего отца». Она сказала мне всезнайку. «Этот тон — удар для меня … подожди, что?» Я спросил.

«Подождите, что к чему?» — спросила Мади. «Ничего. Итак, насчет этого голокрона. Что именно он делает?» Я спросил. «Помогает мне тренировать свои способности, боевые навыки и разговаривать с духом моих родителей», — объяснила Мади. «Знаете, это напоминает мне о тренировках, которые мы еще не прошли.И я здесь уже три с половиной недели », — напомнил я ей.

« Должно быть, я ускользнул из моей головы ». Она сказала. «И я не имею в виду тренировку с самоцветами. Я знаю, что в конце концов ты можешь заставить Перл сделать это. Я имею в виду тренировку, чтобы контролировать свою ки. — сказал я ей, когда она вытащила жемчужную кнопку. — Что ж, есть кое-кто. Но я не думаю, что вы хотите, чтобы он был наставником, не так ли? — спросила Мади.

«Вы» просите кого-то, кто выжил в лавине, выживал и Джема, и Сабрины каждый день, хранил свою магию в секрете от Гриндейла, притворялся ведьмой в течение 4 месяцев, превратился в Супер Саяна шесть месяцев назад и сохранил свою магию. здравомыслие не нарушено спорами и чушью Перл и Яго, не так ли? Я невозмутимо кричал на Мади.«Попробуйте выжить, чтобы заработать на жизнь Frieza, Cell, Buu, Broly, Tuffles, Shadow Dragons, Androids и Demons». Мади сказала мне. «Frieza слабая даже по нынешним меркам». Я сказал ей. «Адская форма Frieza говорит вам об обратном», — сказал Мади.

«Даже ты должен признать, что Frieza может быть побеждена наполовину сайаном, и даже не в полную силу», — сказал я ей. «Я имел в виду, когда он ответил. был угрозой для Намека ». Она сказала.« Да, до того, как он стал более мертвым, чем обычно ». Я сказал.« Ты хочешь эту тренировку или нет? »- спросила Мади.«Да, я чувствую, что мы превращаемся в шутку критиков, которая длилась слишком долго», — сказал я, когда мы поднимались наверх.

«Скажи это Черри», — сказала Мади. «Кто?» — ошеломленно спросила я. Не спрашивай. Особенно, когда дело касается ее друзей и того, кого они называют Дреллом. — сказала Мади, прикрыв голову ладонью. «Что, черт возьми, такое Дрелл?» Я спросил. «Мэджик Питер Гриффин, претендующий на роль« наставника Черри и Аттикул »», — сказала Мади немного раздраженно. «Звучит немного разочаровывающе». — прокомментировал я.«Это не так плохо, как Черри, идущая с кем-то еще», — сказала Мади.

Позже я ждал в пустой комнате, которая, по словам Мади, будет тренировочной. «Я бы хотела взять свой iPod, чтобы послушать музыку. прочь от скуки ». Я сказал себе, как только Мади открыла дверь.« Надень эту повязку на глаза », — сказала Мади, случайно бросив в меня кирпич.« Ой », — сказал я. «Сфокусируйся!» — закричала Мади, хлопнув по руке, — «Я могла бы просто оторвать часть занавески и использовать ее как повязку для глаз.«Сказал я, осторожно потеряв лицо.

« Это тоже », — сказала Мади, когда сделала это и обернула им мои глаза.« Внезапно у меня начинается дежавю. Как будто я снова нахожусь в шахте ». Я заметил. «Здесь нет мин на много миль», — сказала мне Мади, куда-то проводя меня. «О, спасибо Салмонею. Для меня это было бы ужасно », — сказал я с облегчением.

« Вместо этого, вот ваш инструктор прямо здесь ». — сказала Мади, снимая повязку. Передо мной был Гоку, почему-то в красном ги.А рядом с ним была Вегета, которая выглядела так, будто его тащили за собой. «Не могу поверить, что вы привели меня сюда, леди!» — воскликнула Вегета, обращаясь к Мади. «Ах, заткнись, педик!» — сказала Мади Вегете, которая выглядела потрясенной, когда ее так назвали.

«Мы все знаем, что такое твой отец». готово. » — добавила Мади, указывая на Вегету. «Хорошо, мы поняли, дамы. Вы оба красивы. Что, черт возьми, здесь происходит ?! »- спросил я всех в комнате.« Вы хотели пройти обучение ки, поэтому я получил 2 мастера этого навыка. Собственно, полтора.- сказала Мади с ухмылкой. — Так ты Аарон? — спросил Гоку. «Да, и я считаю, что твой друг — князь дорожных конусов из-за его волос». — сказала я, указывая на волосы Вегеты.

«Волосы Вегеты были в семье из поколения в поколение!» — воскликнула Вегета. Или сундуки. Или даже Булла, если на то пошло. Я пожал плечами, поскольку Вегета был ошеломлен. «Ха!» — сказала Мади. «Я поражена. Гетес обычно говорит что-то вроде« Не смейся над принцем всех сайян и привилегий ». «Сказал Гоку.«Ого, этот титул — вещь популярная, или кто-нибудь может быть избран князем Сайянов?» Я спросил.

«Поскольку они» находятся под угрозой исчезновения, королевской семьи нет. Он просто так думает, потому что считает себя «выше». — сказала Мади, закатывая глаза. «Дрэц! Вот и шутка дня». — сказал я, бросая газету в мусорное ведро. «Я оставлю вас, ребята. Достань меня, когда все закончится. — сказала Мади, уходя.

«Итак, вы двое действительно можете обучить меня, или это оправдание для вас двоих сражаться, не разрушая планету?» Я спросил Гоку и Вегету.«Первый вариант, который ты сказал». — сказал Гоку. «Ура!» — сказал я, подняв руки вверх, случайно выстрелив через крышу случайным ки-разрядом. «Упс!» Я сказал. «Ну, по крайней мере, ты можешь стрелять ки из руки». — сказал Гоку. «А как насчет того, чтобы контролировать это?» — спросил я его, когда он начал нервно потеть. «Это самая сложная часть», — сказал он, когда Вегета больше не ошеломила.

Вскоре мы оказались посреди комнаты, и я снял толстовку. «Так что, черт возьми, мы делаем?» Я — спросил Гоку, как будто это было очевидно.«Я знаю это! Я имею в виду, что мы делаем в первую очередь? Стреляем из рук гигантскими энергетическими лучами? Увеличиваем наши поцелуи? Просто бьем людей …?» — спросил я, прежде чем меня прервали. «Уклоняться!» — сказал Гоку, прежде чем ударить меня кулаком в живот.

«Ой! Как ты думаешь, TeamFourStars? Боже, мне нутром кажется, что это превратилось в черную дыру, вывернутую наизнанку, и не в хорошем смысле!» — воскликнул я Гоку. «Упс, я думал, ты уклонился», — сказал Гоку. «Ты правда думаешь, что приказание кому-то уклониться заставит их увернуться ?!» — саркастически спросил я, не сломалась ли моя кость сарказма…с надеждой.

«Возможно, нам придется поработать над этим позже». — сказал Гоку, нервно потирая затылок. «Думаешь?!» — спросила я перед тем, как меня тут же вырвало. «О боги, такое чувство, будто мое сердце вышло наружу». — сказал я во время рвоты. «Это потому, что это произошло», — сказал Гоку. «Ну, пошли меня на хуй», — сказал я, прежде чем упасть на бок. «Ой». Я застонал от боли.

Вскоре после перерыва бобов сензу и переливания сердца конечно), мы были посреди другой комнаты. (Ну и дела, сколько там комнат?) «Что мы теперь будем делать? Сломать позвоночник? »- саркастически спросил я.«Бэйн опередил меня. Но нет, он летит», — сказал Гоку. «… Какого хрена? Ты знаешь Бэйна? »- спросил я.

« Я однажды дрался с Суперменом, в конце концов я узнал о Лиге справедливости и их врагах », — сказал Гоку.« О, тебе повезло. «Я встретил маленьких титанов!» — пожаловалась Вегета. «Что теперь?» — спросила я в замешательстве. «Лучше не спрашивать». — сказал Гоку. «Они раздражают», — сказал Вегета. «Но единственное, что меня раздражает, — это раздражающий апельсин, и он был забавным. Особенно с его видео Баттмана, — сказал я, когда Вегета закричала от ярости.

«Ну вот и случилось. А теперь насчет полета?» — спросил Гоку. «В том-то и дело, что я не умею летать, Шерлок Холмс». Я сказал. «Вы не умеете летать ?! Это все равно что сказать, что кошки не танцуют! — потрясенно сказал Гоку. — Ты шутишь или честно? Если да, то ты на травке? »- спросил я.« Нет, но я на посеве! » — сказал Мади сверху. «Мади, я в шоке! Я ожидал, что это сделает Яго! »- сказал я ей.

« Мади, что это? Вы берете семена? !!! »- сказал Джонтрон, появившись из ниоткуда.« Откуда вы пришли? »- спросил я.«Ваши фамильные драгоценности». — гордо сказал Джонтрон. «Мне сейчас нужна терапия». — сказал я, когда Мади появилась из дыма с кушеткой. «Так скажи мне, когда у тебя начались проблемы? Опять Хильда ?!» — спросила Мади.

«Покажи мне, пожалуйста, как летать. Спаси меня от этой реальности!» Я умолял Гоку. «Ну ладно». Сказал Гоку, схватив меня за руку и взлетев на десять футов. «Теперь я отпущу, а ты собираешься летать, хорошо?» — спросил Гоку. «Ты делаешь это слишком легким». Я сказал ему. «Это легко. Я имею в виду, что я летал, когда был на несколько лет старше тебя.«Гоку сказал.« Да, потому что тебя этому учили », — сказал я.

« Ну, теперь твоя очередь. Лети, мой ученик! Лети! » — сказал Гоку, отпустив меня. «Какарот, ты сорвал Волшебника Старый ?» — спросила Вегета. «Вегета! Конечно, нет! Я сорвал Оз, Великую и Могущественную». Гоку сказал просто, когда я упал. «АААА !!!» Я закричал, прежде чем резко приземлиться. Или, в данном случае, поверх рулетов для пиццы. Какая разница, это даже не смягчило мое падение.

«Ой», — сказал я с болью.«Мои роллы с пиццей! О нет, как я собираюсь отправить их по почте случайным гребаным людям на улице!» Жаловался старик в инвалидном кресле или кто-то еще. «Ты серьезно?!» Я посмотрел на него. «Да. Теперь, как я собираюсь загнать женщин в свой подвал, где мои внуки играли со своими игрушками из эпизода 1« Звездных войн », когда он вышел?» Он спросил. «Тебе нужна помощь. Как серьезная помощь». Я сказал. «Мне нужна помощь? Это вам нужна помощь!» — сказал он, бросая в меня кучу мебели. «Уклоняйся!» — сказал Гоку.

После той катастрофы мы были в пустой комнате.Мади сказала, что здесь мы не можем умереть. Я думаю, она злится на Гоку за то, что произошло до сих пор. Итак, какой еще «тренировочный» опыт мы проводим? И под этим я имею в виду смерть. — сказал я саркастически. — Как насчет того, чтобы выжить, когда принтер ударил вас несколько раз. — сказал Гоку, потирая голову. чтобы увернуться, вы не можете научить их летать. Черт, я даже не могу получить ускорение Zenkai правильным образом. — сказал я, когда Вегета выглядел потрясенным, прежде чем рассмеяться. Я бросил носок с маслом ему в лицо.Он промахнулся и получил его ниже пояса. Это было супер эффективно. «Прямо… в… круглых… столах». — сказала Вегета от боли, прежде чем упасть от боли.

«Кто кого обдирает, Гетес?» — спросил Гоку с улыбкой, прежде чем посмотреть на меня. «Ты можешь пойти в Супер Сайян?» — спросил он. «Да, почему? Ты хочешь, чтобы я победил тебя в конкурсе блондинок? »- саркастически спросил я, глядя вниз.« Сражайся со мной », — просто сказал Гоку.« Что? »- спросил я, глядя вверх.« Ты меня слышал. Сразись со мной всем, что у тебя есть. Вы утверждаете, что вы самый низкий, вы смотрите на сайяна, который вырос как человек.И мастеров у меня больше, чем у вас. Так что сражайся со мной. «Сказал Гоку.

» В любом случае, какой смысл? Мы оба знаем, что ты сильнее меня благодаря опыту и тому подобному. Я сказал. «Парень такой сильный, как Радитц, что сказал?» — спросил Гоку. «Как вы меня только что назвали?» — спросила я, разозлившись. «Ой, простите. Просто ты себя унижал. Я должен был понять, что ты не такой сильный, как Радиц, ты такой же сильный, как один Сайбамен. Гоку продолжил.

«Ты что, меня слабым называешь?» — спросил я его, чуть не ударив его по глупому счастливому лицу.»Вы угрожаете, мастер-джедай?» — поддразнил Гоку. «Я собираюсь заставить тебя желать, чтобы Броли овладел тобой!» — закричал я. «Я Сенат!» — сказал Гоку, когда я повернулся к Супер Сайяну и побежал к нему. «Знаешь что ?! Ешь дерьмо, ублюдок! »- сказал я, когда собирался ударить его, но он схватился за кулак.« Тогда это — измена ». Сказал Гоку с улыбкой, прежде чем попытаться сорвать издаваемый Сидиусом звук.

«Вот и все! «Ты мертв! Нет, даже лучше! Ты — история!» — воскликнул я, пытаясь пнуть Гоку, но он увернулся.«Хватит уворачиваться! Это не TeamFourStars, где уклонение — главная шутка!» — воскликнул я, когда Гоку пролетел выше. «Позволь гневу течь сквозь тебя, юное Измерение. Супер Сайян силен с тобой, юный мальчик». — сказал Гоку. «Перестань издеваться надо мной!» — сказал я, прыгая над Гоку и стреляя в него несколькими выстрелами ки.

Только для того, чтобы он отмахнулся от них. «Сила Мэри несущественна для силы Гоку. У тебя есть гнев, у тебя есть ненависть. Но ты не используешь их, по крайней мере, неправильно», — сказал Гоку. «Перестань говорить!» — сказал я, когда я ударил Гоку на землю моим щитом.«Попробуй уйти сейчас». Я бросил вызов, только чтобы Гоку сделал это, и как Супер Сайян тоже.

«Я — все сайяны». — сказал Гоку. «Это будет конкурировать с мемом« Сделай это », который начал Палпатин. И оба взяты из его цитат». — сказала Мади на заднем плане. «Почему ты не останешься внизу?» — воскликнул я Гоку. — прокомментировал Мади.

«Сделай это». — сказал Гоку. «Вот и все !!!!» — сказал я, сложив руки вместе, и вся ки составляла сферу.То, что я снимал, было не «обычной волной Камехамеха», а «Заключительной волной Камехамеха». ЧТО ЭТО ЛЕТУЧИЙ ВИТАМИН D !!!!!!!!! »- воскликнул Вегета из-за спины Мади, когда ки отправились в Гоку. наотмашь старику. «Что за …. ОН НЕТ !!!!!!!!» — сказал старик перед тем, как его ударили. Гоку, Вегете нужно снова сделать прививку от бешенства. И его противосудорожные препараты тоже ». Мади пошутила. По крайней мере, я думаю, что она пошутила.« Видишь ли, этот бой просто доказывает, что ты слишком силен для меня! Так в чем весь смысл этого боя ?! » — спросила я, глядя на Гоку.»Чтобы проверить вас». — сказал Гоку. «Испытай меня? Испытай меня на чем? !!!» — спросил я у него.

«Смотри, у тебя есть искра Мэри. Но необученный или даже неконтролируемый, это может быть опасно. Если не освоить должным образом, вы. Воля. Обидите своих близких или погубите себя! »- предупредил Гоку.« Тогда почему бы просто не сказать об этом? Зачем проходить всю эту издевательскую игру? Я имею в виду, что это вообще значит для тебя …? »Меня прервал удар по голове Столбом Электростанции.

« Зачем проходить обучение Мэри, если для тебя «Это не имеет значения» .»Гоку спросил, используя кавычки.» Потому что я просто хочу защитить людей, с которыми я дружу «. — возразил я. «Ну, ты не можешь делать это, действуя как Броли, Броли БР, Мэри или Халк все время, когда в Super Saiyan убивает выносливость быстрее, чем холодильник Гетеса, бегущий в логово Гринча», — сказал Гоку. Линк, если бы меня никогда не учили путям Сайана, как ты и Гетес, — сказал я.

«Сарказм не является оружием, равно как и Спеллман». — сказал Гоку. «Ты действительно думаешь, что я буду использовать Сабрини как оружие? У тебя низкие ожидания от меня, ты бездушное существо.»Я сказал Гоку.» Я никогда не говорил кто, не так ли, Камень Близнецов? » — сказал Гоку. «Мне не нравится Джем, поэтому не называй ее имени». Я сказал ему. «Тогда перестань сомневаться в себе. Ты можешь, единственный враг, который у тебя есть, — это ты сам или нюхательная ведьма Тим». — сказал Гоку. «Как вы узнали об этом?» Я спросил. «Кнопка маффина». — сказал Гоку, протягивая кнопку.

«Хотите?» Он спросил. «Нет, спасибо.» Я сказал ему. «Ну, что ты собираешься с этим делать?» — спросил Гоку, прежде чем я схватил его столб силы и бросил его Мади.«Сделать этот бой честным. У меня нет оружия, и ты тоже не сможешь», — сказал я Гоку. «Это не было оружием. — гордо сказал Гоку, позируя. «… Что ты, Рафики?» Я спросил. «Ваш личный Рафики». — сказал Гоку. «Что это делает Мади, Шрам?» Я спросил.

«Нет, Малефисента». — с радостью сказала Мади. «Старый или переделанный?» Я спросил. «Какой из них поддерживает вас в живых?» Спросила она. «Ни из-за этого проклятия». — сказал я с ухмылкой. «Я СМЫСЛ, КАКОЙ ВАРИАНТ, ТЫ ПОЛОВИНУ ВЫПЕЧИЛ МЯСНЫЙ ПУШКУ? !!» Мэди закричала голосом, имитирующим Яго.«Ой. Ни то, ни другое». — сказал я перед тем, как убежать, когда Мади преследовала меня с катаной. «… Я знал, что мне нужно получить турбо», — сказал Гоку, капая потом. «Ха! Я ехал с максимальной перегрузкой. Привет-да! «Сказал Вегета, прежде чем Мади отрезал ему руку.

» … Ну, это воняет. «Сказал Мади, когда Вегета закричал, размахивая руками.» Гетес, хватит махать рукой! » Так ты потеряешь больше крови! К тому же, я не думаю, что кто-то захочет проглотить твою кровь, даже с той единственной проблемой со здоровьем! »- воскликнул Гоку, прыгая на Вегету.

(Комментарий автора: Вот и все. Эта интерлюдия прыгнула на акулу. Нам нужно перезагрузить весь процесс. Он перегружен большим количеством шуток, чем набросок Робот-Цыпленка. Приготовьтесь промывать шутки. * Эндрю использовал туалет. Он смыл шутки. [это все равно не туалетный юмор] * Ура, мы сохраняем эту интерлюдию! Эндрю: Эй, твои песни из Big Time Rush и телефон вылетели из унитаза. НЕЕЕЕЕЕЕТ !!!!!)

После всего этого, и Вегета вернул руку через боб сэндзу, Гоку и я снова вернулись в пустую комнату.«Итак, вот что произойдет, если вы перейдете на максимальную перегрузку, — прокомментировал я Гоку. — И вот что произойдет, если вы посмотрите это шоу». — сказал Гоку.

«Итак, что будет дальше?» — спросил я. «Камехамеха!», — сказал Гоку, стреляя из луча. «ААА !!!!» Я закричал, пригнувшись, и он снова попал в старика. — сказал он перед тем, как попасть в него. «ЧТО С ВАМИ НЕВЕРНО? !!!» — спросил я Гоку. ПЫТАЕТСЯ УБИТЬ МЕНЯ ?! »- спросил я.

«Я думаю, ты снова убил пиццу мистера Плинкетта», — заметила Мади. «НЕ ПОМОГАЕТ!» — сказала я ей. «Узнай это, черт возьми!» — кричала на меня Мади. как будто я могу сделать это за десять секунд. Я имею в виду, это не похоже на то, что я просто сложил руки, просто сказал «Камехамеха» и так снимал, хорошо? » — саркастически спросил я, не понимая, что я только что сделал. «Эй, крошечный лазер». — сказал Гоку. «Какие?» — спросила я, заметив это, направляясь к ноге Мади.

«МОЯ НОГА !!!!!» — сказала Мади, как бегущий кляп на Spongebob Squarepants.»ХА !!!» — сказала Вегета, но Мади ударила ее ножом в плечо. «Мне нужен взрослый». Я сказал. «Я взрослый». — сказал Гоку с улыбкой. «…» Я уставился на Гоку. «Какие?» — сказал я через несколько секунд.

Вскоре мы вернулись на летающую площадку. «Почему мы делаем это снова? Все это просто докажет, что я падаю». Я напомнил Гоку. «Потому что я никогда не бросал тебя в небо». — сказал Гоку. «Какие?» — спросил я, прежде чем меня бросили. «Я НЕНАВИЖУ ЭТО !!!!! ААААА !!!!!» Я кричала как девочка, когда была в небе.

«Не волнуйтесь!» Просто сфокусируйте всю свою ки в центре своего существа! »Гоку сказал свой совет.« Тебе легко сказать! Не ты падаешь! — воскликнул я. «Просто сделай это! Представь, что ты дышишь, но своей энергией», — сказал Гоку. «Хорошо», — сказал я, закрыв глаза и сфокусировав всю ки в центре своего тела.

«Посмотри, что сделал Я говорю тебе? »- сказал Гоку с ухмылкой, когда я открыл глаза, чтобы увидеть тот факт, что летаю.« Что ты не пытался бросить меня в последний раз ». Я сказал ему.«Ну вот и перестать сомневаться в себе». — сказал Гоку, похлопывая меня по спине.

«Я думаю, ты уловил это». Сказал он с улыбкой. «Вы уверены?» Я спросил. «Да. Я тренировал Гохана и Ууба, и посмотрите, насколько хорошо они вышли». — сказал Гоку. «Я бы хотел, но их здесь нет», — сказал я с каплей пота. Я забыл об этом, — сказал Гоку, смеясь, когда я упал лицом.

Вскоре мы вернулись в обычную комнату, где Гоку насмехался надо мной раньше. «Итак, что мы делаем на этот раз? Мусорный день ? — саркастически спросил я.«Нет. Так как ты можешь летать с ки, теперь мы собираемся научить тебя правильно стрелять ки. И хватит сарказма, это похоже на то, что ты используешь его как оружие », — сказал Гоку.

« Извините, если мой опыт в Гриндейле и прошедший год подготовили меня к использованию сарказма, чтобы скрыть свою чувствительную сторону. И я не использую это как оружие, это вещь, которую нужно преодолеть, — заметил я. — Это глубоко. Хочешь поговорить об этом? — спросил Гоку. «Нет. Давай просто сосредоточимся на взрывах ки или что-то в этом роде», — сказал я, меняя тему. «Ладно.«Сказал Гоку, не вдаваясь в подробности.

« Итак, что мне сделать, чтобы Камехамеха стал большим, как это было, когда я был зол на то, что ты издеваешься надо мной? »- спросил я Гоку. это была Последняя Камехамеха. И во-вторых, то же самое и с полетом, за исключением того, что вы «выталкиваете его из своего тела. Просто сосредоточьтесь на количестве, которое вы повторно выпускаете», — просто сказал Гоку.

«Хорошо», — сказал я. Не выпускайте слишком много, иначе у вас могут возникнуть взрывы, такие как те, которые Кулер дал Пикколо.«Гоку предупредил меня, пока я смотрел на него.» … Ладно, я больше не задаю больше вопросов по этому поводу. »- прокомментировал я. «Имею ли я иммунитет?» — подумал Гоку. «Хорошо, я понял», — сказал я.

Вскоре я снова начинаю нажимать на ки в моем теле, на этот раз пытаясь прижать ее к своим рукам. Не скривилась. Похоже, тебе нужно в туалет. В штанах. » — прокомментировал Гоку, когда мое лицо покраснело из-за этого.»Фу, мерзко. Почему ты так говоришь?» — спросил я его, пытаясь прикрыть лицо шляпой. «Эй, твое лицо просто похоже на это». Гоку защищался. «Не могли бы вы прекратить говорить». — умоляла я. «Ok.» Он сказал.

Я снова закрыл глаза и сосредоточился на том, чтобы выбросить огромное количество ки из моих рук. Через пару секунд я почувствовал его ладонями и решил использовать тот же энергетический взрыв, что и раньше. «Финал Камехамеха!» — сказал я, выставив ладонь наружу, прежде чем сложить их вместе и произвести мощный взрыв.Только для того, чтобы он прошел сквозь стену и уничтожил машину Мади.

«Хех, это напоминает мне, когда я впервые сделал Камехамеха, и я взорвал машину, которую мы использовали в то время. Однако удивительно, что вы знаете комбинацию для него и Final Flash. Думаю, это может быть ваш фирменный ход, а? Кроме того, ты не ожидал такого взрыва, не так ли? — спросил меня Гоку.

«О, милая мать Иисуса, Мади убьет меня. А потом она убьет тебя. Если только… — сказал я, остальное было тарабарщиной себе под нос.«О, ну, просто не рассказывай ей о Шарах Дракона», — сказал Гоку. «Поверь мне, я не думаю, что даже эти вещи могут исправить ущерб, который она тебе нанесет». «… Согласен.» Сказал Гоку, когда мы отправились на следующую тренировку.

Наконец, мы прошли обучение Супер Сайяну. «Итак, почему мы делаем это снова?» — спросил я, уклоняясь от Гоку. удар … без его крика уклоняться. «Уклоняться!» Однако некий конусообразный «принц» выкрикивал эту бесполезную ерунду. «Чтобы вы могли привыкнуть к силе Супер Сайяна и использовать ее, не навлекая на людей весь Броли.А также, чтобы ты мог быть супер-сайаном на полную мощность. «Сказал Гоку, схватив меня за ногу, только чтобы получить удар другой.

» Хех, ты получил хороший удар. «Сказал Гоку.» Спасибо, Ты мог бы поблагодарить за это наблюдение за Гераклом и Зеной. «Я сказал.» Зена, я встречал ее однажды в загробной жизни. «сказал Гоку.» Правда ?! Как она?! Нет, что еще более важно, она воссоединилась с Габриель и Евой ?! »- спросила я в полном шоке.« А, да. То есть, когда я видел ее в последний раз, да, на ваш второй вопрос. И чтобы ответить на первый вопрос, она в порядке.- сказал Гоку, нервно потея от моей реакции.

«Круто! Нет, Аарон, ты лучше этого! — сказал я себе, хлопая себя по лицу. «Мы согласны относиться к Зене и Гераклу как к нормальным людям, а не как к Чудо-женщине или даже к Супермену, существам, которые выше вас. Но как к нормальным, обычным людям». Я ругал себя. «Ты в порядке?» — спросил Гоку. «Да, просто иногда просто слишком волнуюсь, как сейчас, когда я вроде как забываю то, что обещал себе». — объяснил я, потирая затылок.

«Хорошо, не буду касаться этой темы». — сказал Гоку. «Я буду!» — спросила Вегета. «Ладно, хочешь сказать это все еще после того, как я надеру тебе задницу ?!» — усмехнулся я. «Ха! Ты, подросток, который с трудом сдерживает свой гнев и не умеет пользоваться ки, думаешь, что он может победить меня ?!» — издевался Вегета. «Что ж, если ты слишком глуп, чтобы драться со мной, тогда, думаю, я просто останусь здесь с Гоку в качестве вызова». Я подстрекал. «Сейчас идет, мальчик!» — воскликнула Вегета, приземлившись передо мной и повернувшись к Супер Сайяну.

«О нет, ты надеваешь свои большие детские перчатки.Что мне делать? »- саркастически спросил я.« Меня бьют », — сказала Вегета с ухмылкой.« Да, нет », — сказала я ему. Впервые ты почувствуешь вкус поражения от моих рук! »- сказал Вегета, летя ко мне кулаком, собираясь ударить меня. Я перекатываюсь под ним и пинаю его в спину.

« О, хо. Вы думаете, что вы — шумиха, не так ли? — спросила Вегета. «Нет, но ты думаешь, что ты шумиха, когда это не так». Я выстрелил в ответ, уклоняясь от его удара. «Вот и все! Попробуй это! »- сказал Вегета, вытянув ладони наружу, заряжая Финальную вспышку.

«Дерьмо». — сказал я, зная, что мне негде уклониться. «Гетес, мы должны тренировать его, а не убивать!» — сказал Гоку. — «Я учу его, учу его побеждать! Последняя вспышка! »- воскликнул Вегета, стреляя из нее.

В последний момент я положил обе руки перед собой, как Лукарио, собирающийся использовать свою силу ауры. Однако вместо этого огромный, нет, в мои руки попало гигантское количество ки, и название атаки ки пришло мне в голову. «Большой взрыв, Камехамеха!» — воскликнул я, когда я выстрелил огромным синим зарядом ки в Последнюю вспышку, уничтожив ее посередине, и это было все еще направляясь к Вегете.

«Ты, должно быть, издеваешься надо мной». — прокомментировала Вегета, прежде чем ее ударили. «Вау, первая его характерная атака — атака Вегито, а теперь он только что атаковал Гогету. Что дальше он сделает, сделает из ки меч? Наказывает души людей с помощью Soul Punisher? А может в шутку выстрелить конфетти из рук? Или еще лучше, использовать атаку Кефлы, на которой я серфил? Гоку прокомментировал мой прогресс.

«Или, может быть, он мог бы сделать энергетические косы и составить План нулевых смертных?» Вегета слабо пошутила, прежде чем застонать от боли.»Гетес, ты дорожишь своей жизнью?» — серьезно спросил Гоку. «Да?» — вопросительно сказала Вегета. «Тогда никогда не говори этого снова. Или я просто сделаю с тобой то же самое, что сделал с Берусом с Perfected Super Saiyan Blue перед тренировкой Ууба», — пригрозил Гоку. «Мип», — кротко сказал Вегета. в конце этой тренировки. Господи, это было похоже на дни, даже на месяцы. «О, это потому, что Мади сделал эту камеру похожей на гипертоническую ягодичную камеру». — сказал Гоку, как-то прочитав мои мысли.»ГОКУ !!!!!!!!!!» Мади закричала из ванны или душа, в зависимости от того, какой из них. «Что? Я просто говорю ему, как правильно это сказать». — сказал Гоку с невинной улыбкой. «Или ты снова со мной беешься?» Я спросил.

«В любом случае, научу вас телепортироваться с помощью ки. В основном, мгновенная передача. По крайней мере, я надеюсь, что вы сможете это сделать, хотя я научился этому за год». — сказал Гоку, меняя тему. «Если вам потребовался год, чтобы выучить это, то как я собираюсь выучить это за короткий промежуток времени?» Я спросил Гоку.«Вам потребовалось немного времени, чтобы сделать то, на что у большинства сайян ушли годы». Сказал Гоку, хваля меня.

«Вы просто кладете пальцы на голову и думаете о том месте, которое хотите, а затем просто путешествуете туда». — объяснил Гоку, когда я приложил пальцы ко лбу. «Правда, вот и все?» — спросил я. «Да, это так просто». — сказал Гоку, когда я закрыл глаза. «Гоку, это не работает. Вы уверены, что мне больше нечего делать? — спросила я, открыв глаза и увидев потрясенного Гоку.

«Что?» Я спросил. «Я только что почувствовал, как ты телепортировался по планете за восемьдесят секунд, чувствуя свою ки». — в шоке сказал Гоку. «Подожди, я сделал это?» Я спросил. «Да, но ты, возможно, захочешь спрятаться». Гоку предупредил. «Почему?» Я спросил. «Потому что вы как бы пошли в туалет, где Мади принимает расслабляющую ванну или душ». Гоку сказал мне, когда Мади вошла в комнату, разозленная.

«ГОКУ, Я ЗНАЮ, ТЫ ЭТО СДЕЛАЛ !!!!» — закричала Мади, бросаясь к нам. «Хорошо, мы признаем это! Перл уничтожила твою машину из базуки! »- сказал я, используя ложь, которую придумал ранее.»ЖЕМЧУЖИНАЛЛЛЛЛЛЛ !!!!!!!!!!» Мади закричала от ярости, преследуя Перл. «Почему ты винил Перл?» — спросил Гоку. «Ты хочешь признать, что ты тот, кто научил меня уничтожить ее машину и принять наказание, которое она назначила?» — спросил я Гоку. «Туше», — сказал он, когда Мади тоже преследовала Яго.

«Почему? меня! »- спросил Яго, когда Мади гналась за ним и Перл, прикрываясь только полотенцем на талии. — воскликнула Мади заглавными буквами. «Хочешь уйти от этого?» Я спросил Гоку.»Конечно.» Он сказал, когда мы уходили.

«Хм, кстати. Почему вы используете сарказм, чтобы справиться с ситуацией?» — спросил меня Гоку. «Потому что я беспокоюсь о многих вещах. Я беспокоюсь, что я могу не понравиться людям за меня. Я беспокоюсь, что богатая девушка вернется в мою жизнь, чтобы устроить ей ад. Я беспокоюсь, что однажды злодеи могут использовать людей, привязанных ко мне. чтобы причинить мне боль. Но в основном я беспокоюсь о том, что, возможно, мой собственный друг может не доверять мне, и то, что случилось с Древом Мудрости, доказывает это ». Я излил правду и свои сдерживаемые эмоции в тот момент, когда понял, что мои собственные проблемы просто ударили меня по лицу.

«Это было не Древо Мудрости». «Это было мошенничество», — сказала Мади из-за фона. «Вы хотите сказать мне, что меня облажала подделка ?!» — спросил я. «Он думает, что продажа чужих душ мне спасет его. Я позволил ему жить». чтобы подшутить над ним. Теперь он — «ваша туалетная бумага, которую вы используете. Иронично. Он продлил свою репутацию, но не себя». — сказал Мади.

«Отлично, теперь меня обманула подделка! Что дальше, свиньи научатся летать? Ад замерзает? Ностальгический критик становится дядей обезьяны ?!» — саркастически спросил я, скользя по стене.«Работа все еще продолжается, Айси планировал, и да, он это делает», — просто сказала Мади. «Я саркастична!» — воскликнул я. «Я не т.» — возразила Мади. Я просто беру случайную подушку и кричу в нее. «Что твоя новая подушка для твоей новой комнаты сделала с тобой?» — спросила Мади.

«В прошлом гребаном году все было плохо притворство! Все, через что я прошел, было подделкой! А все потому, что ты просто хотел подразнить Хильду! Почему ты не мог просто украсть ее душу или что-то в этом роде ?! — воскликнул я. «…» Мади ничего не сказала.

«И вы знаете, что самое худшее? Я наконец знаю, что Сабрини думает обо мне, и она никогда не прислушивалась к моим планам, даже если бы они помогли нам выбраться из неприятностей! Но нет, Сабрина всегда должна быть права. проклятое время! » Я выплюнул. «… Хильда была такой. Для меня». — сказал Мади. «Какие?» Я спросил. «Она всегда ненавидела меня за то, что я была дочерью тех самых ситхов, которые сделали Ревена, Малека и Малгуса теми самыми ситхами, которыми они были. Я никогда не хотел этого наследия. ее слова: «Дарт Сатанус!» — сказала Мади.

«Вау, и я подумал, что она никогда не рассказывала Сабрине о консилере и давала его мне, когда мне было четыре года, — это плохо». Я сказал. «Тебе не угрожали смертью из республики каждый день в твоей жизни, не так ли?» — спросила Мади. для остального мира «. Я сказал.

» Вы легко выходите. «Сказал Мади.» Может так, а может и нет. Я застрял в уборке после беспорядка Сабрини, использую заклинания стирания памяти слева и справа и так нервничал два года назад, что были внесены коррективы, когда я собирался поступить в Академию Чернокнижников.А потом были вы и все «я», заставляю вас вступить в этот контракт, нравится вам это или нет «отношение». Я сказал. «По крайней мере, твои родители любят тебя. Мой отец считал меня чертовой мерзостью до такой степени, что утверждал, что его единственная дочь была моей младшей сестрой». — сказал Мади.

«И формально я являюсь причиной смерти моего дяди». Я сказал. «Он хотел меня, мертвых!» — воскликнула Мади. «Послушайте, я не знаю, правда это или нет, поэтому я не спорю. Но если с этого момента жизнь будет такой, мы должны прекратить, вы знаете, избегать друг друга и пойти навстречу.«Я сказал.

»… Однажды я расскажу тебе свою историю. Но только если ты расскажешь мне свою. И я хочу «пустую правду» ». — сказала Мади, изображая каламбур. «Хорошо, если вы не возражаете против дырок в нем, — сказал я. — Могу я пойти? Гетес собирается выпить угловой. «Сказал Гоку, когда мы с Мади поняли, что забыли, что он был там.» Да, продолжай, или я буду есть Чи-Чи на ужин «. — сказал Мади. «Не Чи-Чи!» — воскликнул Гоку перед уходом, увлекая за собой Вегету.

«Это было неловко». Я заметил. «Полные сайяны. Разрушительные моменты с тех пор, как эволюция дала им легкий выход.«Сказал Мади.« Итак, ты хочешь преследовать Перл и Яго? »- спросил я.« Черт возьми, да! »- сказала Мади, вытаскивая меч, а я вытащил огнемет.« Это «День мусора!» — сказала Мади, пока мы гнались за двумя надоедливыми фанатиками. И Мади все еще думает, что они взорвали ее машину.

(Отказ от ответственности: мы с Эндрю не владеем Черри, Аттикусом или кем-либо из их друзей. Они принадлежат PerkyGoth24)

Летняя исследовательская стипендия | Аспирантура

Аспирантура обеспечивает финансирование, чтобы помочь аспирантам в защите диссертаций и диссертаций исследовательские проекты во время летней сессии.Это финансирование предназначено для поддержки студентов, которые не работают в KU летом. Получатели должны подать заявку на исследование, показывающую, как грант на финансирование ускорит их получение степени. В случае награждения получатели также должны отправить донору благодарственное письмо летом и представить двухстраничное обсуждение (до 1 сентября) результатов исследования или результатов, достигнутых в результате летнего финансирования. Эта стипендия не предназначена для набора новых студентов в KU.

Крайний срок подачи заявок — 18 апреля 2021 года.


Право на участие

Любой аспирант KU, отвечающий всем следующим критериям, может быть номинирован:

  • Имеет хорошую академическую успеваемость;
  • Записались минимум на один час на летнюю сессию;
  • Ранее не получал финансирование в рамках Летней исследовательской стипендии (SRS).

Процесс выдвижения и отбора

Номинации рассматриваются и присуждаются каждой весной аспирантами.Каждое отделение может назначить до двух студентов, которым будет оказана летняя поддержка. Номинации должны быть представлены в электронном виде до полуночи 18 апреля -го , чтобы иметь право на финансирование летом 2021 года. Номинации должны быть представлены с использованием онлайн-формы. Исключений не будет.

Предпочтение будет отдаваться а) докторантам, которые сдали комплексный экзамен до крайнего срока подачи заявки, и б) студентам из недостаточно представленной студенческой группы.

Запись на летнюю сессию 2021 года обязательна. Ожидается, что летняя исследовательская стипендия будет основной формой финансовой поддержки студентов в течение лета. Студенты не имеют права на получение финансирования SRS, если они соглашаются на назначение GTA / GRA / GA одновременно с получением награды.

Директора и координаторы департаментов могут подать заявку, заполнив онлайн-форму . Для номинации потребуется три приложения, которые необходимо загрузить в формате Word или PDF:

  • Заявление о выдвижении кандидатуры или рекомендация отдела студента, предпочтительно от его научного консультанта или директора по последипломному обучению;
  • Четко сформулированное предложение от студента (одна страница) с конкретными деталями их плана исследования; и
  • Биографические данные или резюме студента.

Номинаторы получат системное подтверждение того, что их номинация была успешно отправлена ​​после заполнения онлайн-формы. Неполные заявки рассматриваться не будут.

Хотя время, необходимое для обработки решений о присуждении контракта, будет зависеть от количества полученных заявок, мы стремимся уведомить всех номинантов и аспирантов по электронной почте до пятницы, 30 апреля, -е, .


Администрация премии
  • Участники получат стипендию в размере 5000 долларов США, зачисленную непосредственно на их счет в KU до того, как придет срок оплаты их летнего счета за обучение.
  • Победителей необходимо зарегистрировать летом, чтобы их награда была опубликована в их аккаунте.
  • Победители должны отправить благодарственное письмо донору, ответственному за их награду (информация о доноре будет предоставлена ​​в уведомлении по электронной почте).

Примечание. Студенты, которые уложились в крайний срок окончания учебы в начале лета, не имеют права на получение этой награды.

Если у вас есть какие-либо вопросы, напишите на [email protected]

ИННОВАЦИЙ В ТРАНСПОРТНОЙ ОТРАСЛИ ОБСУЖДАЮТСЯ В ТЕХНОПАРКЕ «КАЛИБР»

.

28 июня 2018 г., с 10.С 00 до 18.00 на территории Технопарка «Калибр» пройдет II Ежегодная конференция «Инновационные решения и новые технологии, меняющие транспортную отрасль».

Мероприятие организует Технопарк «Калибр» при поддержке Департамента науки, промышленной политики и предпринимательства Правительства Москвы; Ассоциации «АВТОНЕТ», Ассоциация операторов и разработчиков беспилотных авиационных систем, Московское городское агентство инноваций и Российско-Сингапурский деловой совет при Торгово-промышленной палате Российской Федерации.

В соответствии со стратегией развития автомобильной промышленности страны до 2025 года перед рынком стоят амбициозные задачи по внедрению электромобилей, беспилотных автомобилей и созданию соответствующей инновационной инфраструктуры. Решение этих задач требует консолидированных усилий всех участников нового для страны рынка.

Конференция проводится для обсуждения актуальных актуальных проектов в области беспилотных автомобилей, законодательных изменений, отечественного и международного опыта.

Как стимулировать отечественные разработки в сфере инновационного транспорта? Станут ли беспилотные автомобили повседневной реальностью в России? Какие законодательные изменения нужны отрасли? Какие технические решения по улучшению инфраструктуры предлагают иностранные и отечественные компании?

На эти и другие вопросы в ходе оживленной дискуссии ответят участники и спикеры деловой программы, в том числе представители Департамента транспорта и развития дорожно-транспортной инфраструктуры города Москвы; ГКУ ЦОДД; ГК «Автодор»; МЧС России; ФГУП НАМИ; МАДИ; НП «ГЛОНАСС»; Huawei; ООО «Ев-Тек» и другие.

ЗАО «Синтерра Медиа» выступит стратегическим партнером мероприятия по организации интернет-трансляции выступающих.

Формат мероприятия предполагает тематические разделы и выставочную экспозицию (участие в выставочной экспозиции не требует регистрационного взноса).

Официальный сайт мероприятия: http://www.autonomous.moscow/

Для участия в мероприятии, пожалуйста, отправьте свое имя / должность и компанию / телефон / адрес электронной почты на адрес technopark @ kalibroao.ru или пройдите регистрацию на официальном сайте.

Справка: Одной из отраслевых специализаций Московского Технопарка «Калибер» являются беспилотные автомобили и навигационные системы. С 2016 года на территории Технопарка действует полигон беспилотных автомобилей, доступный резидентам и студенческим проектным командам.

Оргкомитет конференции:

Басанец Иван

Тел. / Тел.: + 7 (495) 730 09 24/730 09 19

Моб./ Моб .: +7 (985) 5-365-365

Эл. Почта: [email protected]

участников



Преподаватели / Персонал

Ван, Лихонг

LVWcaltech.edu

Заведующий лабораторией / научный сотрудник

Ку, Гэн

gkucaltech.edu

Старший административный помощник

Пичотта, Кэтрин (Кэти)

pichottacaltech.edu

Postdocs / Research Associates

Название

Время

Электронная почта

Цао, Руи

03/2019 – настоящее время

ruicaocaltech.edu

Ченг, Чжунтао

11/2017 – настоящее время

cztcaltech.edu

Дэвис, Сэмюэл

01/2020 – настоящее время

spxdaviscaltech.edu

Гошрой, Аниндья

07/2021 – настоящее время

aghoshrocaltech.edu

He, Zhe

05/2020 – настоящее время

хежекалтех.edu

Хадрия, Анжул

01/2018 – настоящее время

anjulcaltech.edu

Ли, лей

07/2019 – настоящее время

leilicaltech.edu

Линь Ли

01/2020 – настоящее время

lilincaltech.edu

На, Шуай

11/2017 – настоящее время

shuaicaltech.edu

Раджпут, Судиш

07/2021 – настоящее время

skrajputcaltech.edu

Титимбо Чапарро, Кельвин

09/2021 – настоящее время

titimbocaltech.edu

Ван, Пэн

09/2016 – настоящее время

pw1989caltech.edu

Чжан, Ян

08/2019 – настоящее время

zoengycaltech.edu

Чжан, Идэ

09/2019 – настоящее время

yzhang34caltech.edu

Аспиранты

Цуй, Маньсю,

09/2021 – настоящее время

mccuicaltech.edu

Дхара Венката, Шри Саи Нарасимха (Картик)

09/2020 – настоящее время

sdharavecaltech.edu

Гаррет, Дэвид

10/2018 – настоящее время

dgarrettcaltech.edu

Ху, Пэн

06/2016 – настоящее время

penghucaltech.edu

Кахраман, Сиддик (Сулейман)

09/2021 – настоящее время

skahramacaltech.edu

Ло, Илинь

09/2020 – настоящее время

yilinluocaltech.edu

Олик-Гибсон, Джошуа

09/2020 – настоящее время

jolickgicaltech.edu

Соломон, Самуил

09/2020 – настоящее время

ssolomoncaltech.edu

Тонг, Синь

01/2020 – настоящее время

xintongcaltech.edu

Посетители

Название

Время

С

Эл. адрес

Анвари, Бахман

09/2021 – настоящее время

UC Riverside

Хван, Чисон

04/2017 – настоящее время

Национальный институт стандартов

Мишра, Йогешвар

09/2020 – настоящее время

Гетеборгский университет

мишракалтех.edu

Руссин, Джонатан

04/2021 – настоящее время

Университет Южной Калифорнии

Выпускники (студенты)

Имя Время Диплом и университет Размещение
Фэн, Дази 09 / 1999-08 / 2001 М.С., Биомедицинский инженер, ТАМУ Nortel
Гарсия-Урибе, Алехандро 09 / 2002-12 / 2008 к.т.н., инженер-электрик, ТАМУ WUSTL
Го, Цзицзянь 09 / 2007-01 / 2012 доктор биомедицинских наук, WUSTL, McDonnell Ученый Google, Mountain View, CA
Хай, Пэнфэй 01 / 2013-05 / 2018 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL Стратегия Accenture
Он, Юнь 01 / 2015-12 / 2019 доктор биомедицинских наук, WUSTL
Хемфилл, Эштон 09 / 2013-05 / 2018 доктор биомедицинских наук, WUSTL Член технического персонала, Аэрокосмическая корпорация, Эль-Сегундо, Калифорния
Холлманн, Джозеф 09 / 2003-10 / 2005 Biomedical Eng., ТАМУ RBC Product Development, Канзас-Сити
Hsu, Hsun-Chia 09 / 2014-08 / 2018 доктор биомедицинских наук, WUSTL Postdoc, FDA, Silver Spring, MD
Ху, Сун 09 / 2006-12 / 2010 доктор биомедицинских наук, WUSTL Факультет, Университет Вирджинии, Вирджиния
Имаи, Тору 08 / 2015-08 / 2018 т.D защита отложена, WUSTL
Цзяо, Шулян 09 / 1999-12 / 2003 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Международный университет Флориды, Флорида
Цзинь, Син 01 / 2003-12 / 2007 кандидат биологических наук, ТАМУ
Ким, Чулхонг 09 / 2004-05 / 2009 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL Факультет, POSTECH, Республика Корея
Котхапалли, Шри-Раджасекхар 09 / 2004-05 / 2009 доктор биомедицинских наук, WUSTL Университет штата Пенсильвания
Крумхольц, Арье 08 / 2009-08 / 2013 доктор биомедицинских наук, WUSTL Postdoc, WUSTL, Mo
Ку, Гэн 09 / 2000-12 / 2004 т.Д., Биомедицинский инженер, ТАМУ Канзасский университет
Ли, Мия 05 / 1996-11 / 1997 Биомедицинский инж., ТАМУ
Ли, Чиие 08 / 2011-12 / 2016 доктор биомедицинских наук, WUSTL Masimo, Irvine, CA
Ли, Фангся 09 / 1998-08 / 1999 Biomedical Eng., ТАМУ Университет Томаса Джефферсона, Пенсильвания
Ли, Го 06 / 2010-08 / 2015 доктор биомедицинских наук, WUSTL Videojet Technologies, Inc., IL
Ли, Лей 08 / 2012-06 / 2019 кандидат медицинских наук, Калифорнийский технологический институт Postdoc, Caltech
Ли, Ли 09 / 2004-12 / 2010 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL Постдок, Гарвардская медицинская школа, Массачусетс
Ли, июн 01 / 2000-07 / 2004 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Университет Томаса Джефферсона, Пенсильвания
Ли, Ян 01 / 2014-05 / 2020 доктор биомедицинских наук, WUSTL
Линь, Ли 01 / 2014-12 / 2019 т.Доктор медицинских наук, Калифорнийский технологический институт Postdoc, Caltech
Линь, Шао-Пау 08 / 1994-07 / 1996 M.S., Elec. И комп. Англ., Рис Univ.
Лю Ян 08 / 2010-12 / 2016 доктор биомедицинских наук, WUSTL Postdoc, Caltech, Pasadena, CA
Маркес, Гильермо 05 / 1996-08 / 2001 т.Д., Биомедицинский инженер, ТАМУ Программный директор по раннему обнаружению Научно-исследовательский отдел NIH, MD
Мэтьюз, Томас 01 / 2012-02 / 2014 M.S., биомедицинский инженер, ТАМУ доктор биомедицинских наук, WUSTL; Научный сотрудник, Whiterabbit.ai, Саннивейл, Калифорния
Mehrubeoglu, Mehrube 05 / 1996-09 / 2000 к.э.н., инженер-электрик., ТАМУ Факультет, Техас, A & M-Corpus Christi, TX
Оманакуттан, Картик 01 / 2010-05 / 2011 M.S., биомедицинский инженер, WUSTL Epic, Мэдисон, Висконсин
Праманик, Маноджит 09 / 2005-05 / 2010 доктор биомедицинских наук, WUSTL Факультет Наньянского технологического университета (NTU), Сингапур
Цюй, юань 06 / 2016-03 / 2020 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL
Сакаджич, Сава 09 / 2001-05 / 2006 кандидат биологических наук, ТАМУ Гарвардская медицинская школа
Сиварамакришнан, Матанги 01 / 2004-05 / 2006 M.S., биомедицинский инженер, ТАМУ
Смит, Элизабет Брукс 09 / 2004-12 / 2006 М.С., Биомедицинский инженер, ТАМУ National Instruments, Остин, Техас
Песня, Кванхюн 01 / 2004-08 / 2008 доктор биомедицинских наук, WUSTL Техасская онкология, Форт-Уэрт, Техас
Песня, Лян 09 / 2006-12 / 2010 доктор биомедицинских наук, WUSTL Факультет, Институты Шэньчжэня передовых технологий Китайской академии наук, Шэньчжэнь, Китай
Сузуки, Юта 08 / 2009-12 / 2014 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL Токийский университет
Стивенс, Рассвет 08 / 1994-05 / 1996 M.E., Elec. И комп. Eng., Rice Univ.
Тодорович, Милош 09 / 2002-03 / 2008 кандидат биологических наук, ТАМУ MT Analytics Group, Олбани, Нью-Йорк
Ван Юй 08 / 2008-05 / 2013 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL Accenture
Ван, Сюединг 09 / 2000-08 / 2004 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Univ. Мичиган, Мичиган,
Вонг, Цз Вай (Теренс) 08 / 2014-05 / 2018 доктор биомедицинских наук, WUSTL Факультет, Гонконгский университет науки и технологий, Китай
Син, Вэньсинь 06 / 2012-12 / 2013 М.С., Инженер по электротехнике и системам, WUSTL
Сюй, Минхуа, 09 / 2000-08 / 2004 кандидат биологических наук, ТАМУ W.L. Gore & Associates, Inc., Флагстафф, AZ
Сюй, Сяо 09 / 2003-05 / 2011 доктор биомедицинских наук, WUSTL Postdoc, WUSTL, MO
Сюй, юань 09 / 1999-12 / 2003 т.Д., Биомедицинский инженер, ТАМУ Факультет, Univ. Райерсон, Торонто, Канада
Сюй, Чжун 08 / 2009-05 / 2011 M.S., биомедицинский инженер, WUSTL Microphotoacoustics, Inc.
Ян, Цян 09 / 2011-08 / 2013 Совместная докторантура с Пекином Университет почты и телекоммуникаций, Postdoc, Калифорнийский университет, Ирвин, Калифорния
Яо, банда 01 / 1998-12 / 2000 т.Д., Биомедицинский инженер, ТАМУ Факультет, Univ. Миссури, штат Миссури,
Яо, Цзюньцзе 08 / 2008-12 / 2012 доктор биомедицинских наук Eng., WUSTL Факультет, Duke Univ., NC
Yeh, Cheng-Hung 05 / 2011-05 / 2016 доктор биомедицинских наук, WUSTL Исследовательский институт Honda, США
Юань, Юйчэнь 07 / 2011-12 / 2011 М.С., Биомедицинский инженер, WUSTL доктор философии, Сиднейский университет
Чжан, Чи 08 / 2009-05 / 2014 доктор биомедицинских наук, WUSTL Apple, Купертино, CA
Чжан, Хао 09 / 2001-08 / 2006 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Северо-Западный Univ., IL
Чжан, Жуйин 01 / 2012-12 / 2016 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL Edan Instruments
Чжоу, Фэнбо (Харви) 01 / 2012-10 / 2014 кандидат биохимических наук WUSTL
Чжоу Юн 08 / 2011-05 / 2016 доктор биомедицинских наук, WUSTL Fuji Sonosite, Bothel, WA
Чжу, Лижэнь 01 / 2013-12 / 2017 т.D, биомедицинский инженер, WUSTL Subtle Medical, Пало-Альто, Калифорния
г.

Выпускники (научно-исследовательский факультет, научные сотрудники, Постдоки и сотрудники)

Имя Время Диплом и университет Размещение
Ай, июн 12 / 2003-11 / 2005 доктор философии, Хуачжунский университет науки и технологии, Китай Luminit, LLC, Torrance, CA
Бай, Вэньюй, 07 / 2019-03 / 2020 т.D, Университет Брауна, Провиденс, Род-Айленд
Бао, Вэнь 02 / 2017-02 / 2018 Чжэцзянский университет, Ханчжоу, Китай
Баран, Утку 07 / 2016-06 / 2017 доктор философии, Вашингтонский университет Инженер по аппаратному обеспечению, Microsoft, Redmond, WA
Берри, Роберт 01 / 2010-01 / 2012 Б.С., Чикагский университет, Иллинойс
Bo, EN 10 / 2018-04 / 2019 Доктор философии, Технологический университет Наньян, Сингапур
Чатни, Рамеез 08 / 2010-07 / 2012 Доктор философии, Университет Пердью Fuji Sonosite, Bothel, WA
Cai, De 09 / 2017-07 / 2018 Shanghai Jiao Tong University, Шанхай, Китай
Цай, Синь 12 / 2008-10 / 2013 М.С., Хуачжунский университет науки и технологии, Китай
Чуй, Сян-Чен 08 / 2017-04 / 2018 Национальный университет Ченг Кунг
Даниелли, Амос 01 / 2009-03 / 2014 доктор философии, Тель-Авивский университет, Израиль Факультет, Университет Бар-Илан, Израиль
Eom, Tae Joong 10 / 2011-12 / 2012 т.D, GIST, Южная Корея
Вентилятор, Линран 09 / 2017-06 / 2018 доктор философии, Йельский университет Факультет, Университет Аризоны, Аризона
Фанг, Хуэй, 01 / 2007-11 / 2008 доктор философии, Бостонский университет Факультет, Нанкайский университет, Китай
Фавацца, Кристофер 09 / 2008-07 / 2011 т.D, Вашингтонский университет, Св. Луи, штат Миссури, Клиника Майо, Рочестер, Миннесота
Фанг, Чжаосян 09 / 2017-09 / 2018 Китайский университет науки и технологий
Фэн, Сяохуа 02 / 2017-01 / 2018 Доктор философии, Технологический университет Наньян, Сингапур Постдок, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн
Гао, Лян 10 / 2011-12 / 2014 т.D, Университет Райса, Хьюстон, Техас Факультет, Университет Иллинойса, Урбана-Шампейн, Иллинойс
Гарсия-Урибе, Алехандро 12 / 2008-03 / 2016 кандидат технических наук, инженер-электрик, ТАМУ Zonare, Mountain View, CA
Он, Ю 11 / 2015-08 / 2017 Sichuan Univ., Чэнду, Китай
Hong, Tao 11 / 2010-08 / 2011 т.D, Шанхайский институт оптики и точная механика, Китай Китайская академия наук, Шанхай, Китай
Ху, Сун 12 / 2010-04 / 2013 доктор биомедицинских наук, WUSTL Факультет, Университет Вирджинии, Вирджиния
Ху, Жилин 07 / 2011-08 / 2012 доктор философии, Китайская академия наук, Китай Менеджер, Pharos Scientific, LLC
Хуанг, Бен 09 / 2010-08 / 2013 т.D, Государственный университет Пенсильвании,
Исла Гарсия, Хулио 07 / 2017-11 / 2018 Эдвардс Лайфесайенс
Цзяо, Шулян 01 / 2004-03 / 2004 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Международный университет Флориды, Флорида
Цзин, Джозеф 03 / 2017-03 / 2021 т.D, биомедицинский инженер, Калифорнийский университет в Ирвине, Cepton, Сан-Хосе, CA
Ким, Чулхонг 05 / 2009-08 / 2010 доктор биомедицинских наук, WUSTL Факультет, POSTECH, Республика Корея
Ким, Taewoo 09 / 2016-03 / 2019 доктор философии, Университет Иллинойса, Урбана-Шампейн Postdoc, JPL / Caltech
Кэ, Хайсинь 08 / 2009-08 / 2013 т.D, Университет Миссури-Ролла, Ролла, штат Миссури, WUSTL, Медицинский факультет
Ку, Гэн 05 / 1997-08 / 2000, 01 / 2005-08 / 2009 доктор философии, Техасский университет A&M, Техас Техасский университет, доктор медицины Андерсон Онкологический центр, Хьюстон, Техас
Кумар, Авинаш 04 / 2018-11 / 2019 доктор философии, Мэрилендский университет, Колледж-Парк, Мэриленд
Лай, Пусян

08 / 2010-08 / 2015

т.D, Бостонский университет, MA Гонконгский политехнический университет
Ли, Чанхуэй, 08 / 2006-02 / 2010 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Пекинский университет, Китай
Ли, Чэнминъюэ, 09 / 2015-11 / 2018 Корнинг
Ли, Донг 10/10/10/2018 Сианьский университет Цзяотун, Китай
Ли, Хуэй, 03 / 2003-11 / 2003 т.D, Zhejian Univ., Китай Факультет, Фуцзянь Педагогический университет, Китай
Ли, Цзинвэй 10/10/10/2018 Чжэцзянский университет, Китай
Ли, Мэн-Линь 08 / 2004-07 / 2006 доктор философии, Национальный университет Тайваня, Тайвань Факультет, Национальный Цинхуа Univ., Тайвань
Ли, Ючжи 05 / 2006-04 / 2008 доктор философии, Университет Бен-Гуриона Негев, Израиль Covidien, CO
Лян, Цзиньян 07 / 2012-04 / 2017 доктор философии, Техасский университет, Остин, Техас Факультет Квебекского университета, Канада
Лю, Чанцзюнь 08 / 2009-08 / 2010 т.D, Сычуаньский университет, Китай Факультет, Сычуаньский университет, Китай
Лю, Да 07 / 1994-08 / 1995 M.S., Zhongshan Univ., China
Лю, Хунлинь 04 / 2009-07 / 2011 доктор философии, Шанхайский институт оптики и точная механика, Китай Siemens, Шанхай, Китай
Лю, Яцзин 11 / 2017-11 / 2018 Сямэньский университет, Китай
Ма, Ченг 12 / 2012-08 / 2016 т.D, инженер-электрик, Технологический институт Вирджинии. Факультет, Университет Цинхуа, Пекин, Китай
Ма, июн 03 / 2015-08 / 2016 доктор философии, Гонконгский политехнический университет, Китай
Ма, Лицзюнь 10 / 2011-12 / 2013 доктор философии, Университет Цинхуа, Пекин, Китай NIST
Маслов Константин 11 / 2003-10 / 2021 т.D, МГУ, Россия
Насириаванаки, Мохаммадреза 10 / 2011-04 / 2014 доктор философии, Кентский университет, Кентербери, Великобритания Факультет, штат Уэйн Университет, MI
Не, Лиминг 08 / 2010-09 / 2012 доктор философии, Южно-Китайский педагогический университет, Гуанчжоу, Китай NIH
О, Чжун-Тэк 08 / 2004-05 / 2006 т.D, KAIST, Корея Samsung, Сеул, Республика Корея
Панг, Ченлей 03 / 2018-03 / 2019 Zhejiang University, Ханчжоу, Китай
Переда-Кубин, Давид 09 / 2004-02 / 2006 доктор философии, Университет Кантабрии, Испания Университет Кантабрии, Испания
Плейтез Рафаэль, Мигель 01 / 2015-01 / 2016 т.D, Институт биофизики, Германия Postdoc, IBMI, HelmholtzZentrum Mnchen, Нойхерберг, Германия
Рао, Бин 04 / 2009-12 / 2016 доктор биомедицинских наук, Калифорнийский университет в Ирвине,
Шен, Бинглинь 01 / 2020-01 / 2021
Шэнь, Циминь 12 / 1996-04 / 1998 т.D, Шанхайский институт оптики и точная механика, Китай Калифорнийский университет, Ирвин, CA
Шэнь, Юэчэн 06 / 2015-03 / 2018 Кандидат технических наук, инженер-электрик, WUSTL Университет Сунь Ятсета, Гуанчжоу, Китай
Ши, Цзюньхуэй 11 / 2014-12 / 2019 к.т.н. Лаборатория Чжэцзян
Солохин Николай 09 / 2003-11 / 2003 т.D Ультразвуковая лаборатория S-Lab
Сун, Циюань 08 / 2019-05 / 2021 Доктор философии, инженер-электрик, Университет Кейо, Иокогама, Япония Технический руководитель отдела 3D-зрения, Mech-Mind Robotics
Штейн, Эрих 01 / 2007-07 / 2008 доктор философии, Технологический университет Луизианы, Растон, LA Технический директор Nypro, Коппелл, Техас
Сан, Хайтао 01 / 1998-02 / 1999 т.D, Япония
Sun, Yi 03 / 2003-11 / 2003 к.т.н., Univ. Алабамы, Хантсвилл, AL
Тан, Фейфей 06 / 2019-08 / 2020 Университет информационных технологий Чэнду
Тан, Исюань 09 / 2019-03 / 2021
Тан, Цзяньчжи 02 / 1998-06 / 1998 т.D, RIKEN, Япония,
Тай, Цзянь Вэй 08 / 2011-08 / 2014 доктор философии, Университет Отаго, Данидин, Нью-Йорк Зеландия научный сотрудник постдокторантуры, Колорадский университет в Боулдере, штат Колорадо,
Цыцарев Василий 01 / 2009-06 / 2010 к.э.н., Санкт-Петербургский государственный университет, Россия Кафедра неврологии, школа медицины, Пенсильванский университет,
Ван, Лидай

11 / 2009-07 / 2015

т.D, Университет Торонто, Канада, Городской университет Гонконга
Вэй, Хунчжэнь 06 / 2004-04 / 2005 к.т.н.
Вэй, Сяомин 05 / 2017-08 / 2019 доктор философии, Гонконгский университет, Гонконг
Винклер, Эми 03 / 2011-10 / 2012 т.D, Университет Аризоны, Аризона Authentix, Даллас, Техас
Ву, Тонг 12 / 2018-12 / 2019 к.т.н. Нанкинский университет аэронавтики и астронавтики
Ся, июн 03 / 2010-07 / 2014 Доктор философии, Университет Торонто, Канада Факультет, Университет Буффало, Нью-Йорк
Сюй, Минхуа, 09 / 2004-11 / 2004 т.Д., Биомедицинский инженер, ТАМУ W.L. Gore & Associates, Inc., Флагстафф, AZ
Сюй, Сяо 08 / 2011-12 / 2016 доктор биомедицинских наук, WUSTL
Сюй, юань 01 / 2004-09 / 2004 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Univ. Райерсон, Торонто, Канада
Ян, Ан 10/10/10/2018 Сычуаньский университет, Китай
Ян, Цзямяо 08 / 2015-08 / 2020 т.D, Пекинский технологический институт, Китай
Ян, Джун-Мо 12 / 2007-04 / 2015 доктор философии, Сеульский национальный университет, Сеул, Южная Корея Факультет, Школа естественных наук, UNIST
Ян, Лей 01 / 2019-08 / 2019 Тяньцзиньский университет, Китай
Ян, Синьмай 03 / 2006-08 / 2008 т.D, Бостон Университет, MA Факультет, Канзасский университет, KS
Яо Да-Канг 11 / 2009-07 / 2013 доктор философии, Пекинский университет, Китай Pharos Scientific, LLC
Яо, Цзюньцзе 01 / 2013-06 / 2016 доктор биомедицинских наук, WUSTL Факультет, Duke Univ., NC
Юань, Сяоюнь 06 / 2019-06 / 2020 Университет Цинхуа, Шэньчжэнь, Китай
Земп, Роджер 10 / 2004-06 / 2007 т.D, BME, Калифорнийский университет в Дэвисе, Калифорния Факультет, Univ. Альберта, Канада
Чжан, Хао 08 / 2006-08 / 2007 кандидат биологических наук, ТАМУ Факультет, Северо-Западный Univ., IL
Чжан, Пэнфэй 01 / 2016-01 / 2017 доктор философии, Шанхай Институт оптики и точной механики Китайской академии наук, Китай
Чжан, Сирень 12 / 2013-12 / 2014 т.Д, Институт электрооптики, Китайская академия наук
Чжао, Сюэмэй 04 / 1996-12 / 1999 M.S., UTMDACC
Чжао, Яньюй 01 / 2019-01 / 2020 к.т.н. Бейханский университет
Чжэнь, Цзян 08 / 2010-06 / 2011 т.D, Государственный университет Оклахомы, OK St.Jude LightLab, Бостон, Массачусетс
Чжоу, Шу-Анг 08 / 2006-04 / 2007 доктор философии, Королевский технологический институт, Швеция
Чжоу, Юйжун 08 / 2019-12 / 2020

Специалисты НИИАТ приняли участие в V Международной научно-практической конференции «Транспортное планирование и моделирование»

V Международная научно-практическая конференция «Транспортное планирование и моделирование» прошла с 16 по 17 апреля 2020 года в онлайн-формате.

Организаторами мероприятия выступили Ассоциация инженеров транспорта, Научно-исследовательский институт автомобильного транспорта (НИИАТ), Российский транспортный университет (МИИТ), Государственная компания «Российские автомобильные дороги» («Автодор»), Санкт-Петербургский государственный архитектурный университет. и Гражданское строительство (СПбГАСУ), Московский автомобильно-дорожный государственный технический университет (МАДИ), Координационный совет по организации дорожного движения.

НИИАТ на конференции представлял первый заместитель генерального директора по научной работе, руководитель научно-исследовательского отдела стратегического и инновационного развития автотранспортных средств и инфраструктуры Виталий Комаров с докладом о стратегии эффективной цифровизации автомобильного транспорта.

В первый день мероприятия прошла Пленарная дискуссия в формате прямой видеотрансляции, в которой представители Государственной Думы Федерального Собрания Российской Федерации, Минтранса России, ФАУ РосдорНИИ, ОАО В выставке приняли участие ВЭБ-Лизинг, ГКУ ЦОДД Правительства Москвы, ООО «Казань-Телематика», СИМЕТРА.

Ключевыми темами обсуждения стали текущая ситуация в развитии общественного транспорта, особенно в условиях нынешнего кризиса, вектор развития интеллектуальных транспортных систем в рамках национальных проектов и возможные антикризисные меры поддержки регионов в сложившейся ситуации. .

Вице-президент Ассоциации инженеров транспорта Султан Жанказиев модерировал пленарную дискуссию и отметил, что первый день онлайн-конференции обозначил два проблемных момента, актуальных для реализации национального проекта БКАД — пассажирский транспорт и интеллектуальные транспортные системы.

Также прошла сессия «Реализация национального проекта« Безопасные и качественные дороги », организованная ФГУ« РосдорНИИ », спикеры обсудили перспективы расширения федеральной поддержки общественного транспорта, в частности по приобретению подвижного состава. городских агломераций и рассмотрены методические подходы к оказанию государственной поддержки и процедура отбора заявок, а также презентация «Рейтинга городов России по качеству общественного транспорта», подготовленного SIMETRA.Модератором сессии выступила заместитель генерального директора ФГУ «РосдорНИИ» Екатерина Брязгина.

17 апреля в формате вебинара прошли тематические круглые столы, на которых участники обсудили темы транспортного планирования в проектах, современные инструменты сбора и анализа транспортных данных, интеллектуальные транспортные системы, современные формы мобильности, подходы и методы транспортного планирования и моделирования.

Один из круглых столов был посвящен зарубежному опыту развития транспортных систем.В нем приняли участие зарубежные коллеги из PTV Group (Германия), Steers (Великобритания), WSP (Канада) и Alkutieto (Финляндия).


Изображение со страницы 282 книги «Американский флорист: еженедельное ж…

Название : Американский флорист: еженедельный торговый журнал

Идентификатор : americanfloristw06amer

Год : 1885 (1880-е годы)

Авторы : Американская флористическая компания

Флористы

Издатель : Чикаго: Американская флористическая компания

Библиотека, вносящая вклад Об этой книге : Запись в каталоге

Просмотреть все изображения : Все изображения из книги

Щелкните здесь, чтобы просмотреть книгу онлайн , чтобы увидеть эту иллюстрацию в контексте в доступной для просмотра онлайн-версии этой книги.ПРИ НАПИСАНИИ Сметы, ПОЖАЛУЙСТА, ПРЕДСТАВЛЯЙТЕ СЛЕДУЮЩИЕ РАЗМЕРЫ: l8t. Укажите количество поднимаемых створок. ? nd. Укажите длину и глубину створок (глубина от корня). 3-е. Укажите длину дома. 4-й. Укажите высоту от земли до комфорта крыши. & th. Qlvfl толщина и ширина r * ftsrs от BJ-sh bar. iFlorists, Nurserynien & Seedsmen

Текст после изображения:

GKU EX

Примечание об изображениях

Обратите внимание, что эти изображения извлечены из отсканированных изображений страниц, которые могли быть улучшены в цифровом виде для удобства чтения — окраска и внешний вид этих иллюстраций могут не полностью соответствовать оригиналу.

Выполнено

Активация адаптационных генов, опосредованная регуляторами транскрипции, запускает приобретение спейсера CRISPR de novo | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Получение спейсерных последовательностей de novo наделяет CRISPR-Cas памятью для защиты от вторжения генетических элементов. Однако механизм регуляции приобретения спейсера CRISPR остается неизвестным. Здесь мы исследуем регуляцию транскрипции консервативных генов приобретения спейсера в типе I-A Sulfolobus islandicus REY15A.Было продемонстрировано, что Csa3a, MarR-подобный фактор транскрипции, кодируемый геном, расположенным рядом с кластером csa1, cas1, cas2 и cas4 , но на обратной цепи, специфически связывается с промоторами csa1 и cas1 с несовершенная палиндромная последовательность. Важно отметить, что было продемонстрировано, что уровень транскрипции csa1, cas1, cas2 и cas4 был значительно повышен в штамме со сверхэкспрессией csa3a- и, кроме того, уровни белков Csa1 и Cas1 были увеличены в этом штамме.Кроме того, мы продемонстрировали гиперактивное поглощение уникальных спейсеров в обоих локусах CRISPR в присутствии вектора сверхэкспрессии csa3a . Процесс получения спейсера зависит от последовательности PAM CCN, а выбор протоспейсера является случайным и ненаправленным. Эти результаты предполагают механизм регуляции приобретения спейсера CRISPR, при котором один регулятор транскрипции определяет присутствие вторгающегося элемента и затем активирует экспрессию гена приобретения спейсера, что приводит к поглощению спейсера de novo вторгающимся элементом.

ВВЕДЕНИЕ

Кластерные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы (CRISPR) и связанные с ними гены ( cas ) составляют иммунную систему CRISPR-Cas, которая принимает ДНК от инвазивных генетических элементов, чтобы служить источником памяти, обеспечивающим адаптивную защиту от мобильных генетических элементов ( 1,2). Система CRISPR-Cas широко распространена и обнаруживается примерно в 90% геномов архей и 40% бактериальных геномов (3). Локусы CRISPR состоят из идентичных повторов (обычно длиной 20–50 п.н.), между которыми расположены вариабельные спейсерные последовательности аналогичного размера (4).Повторы обычно консервативны в последовательности в пределах данного локуса и часто содержат частично палиндромные последовательности (5). Спейсеры, напротив, очень разнообразны по последовательности и происходят из мобильных генетических элементов (4,6-8), что привело к гипотезе, что CRISPRs обеспечивают иммунитет против вторжения генетических элементов (9). Богатая АТ лидерная последовательность, расположенная выше первого повтора, способствует транскрипции локуса CRISPR (10,11). Гены cas кодируют разнообразное семейство белков, несущих нуклеазную, геликазную и потенциальную полимеразную активность (9,12), и на основе разнообразия белков Cas системы CRISPR-Cas были сгруппированы в три основных типа: тип I, тип II и III типа, которые в дальнейшем делятся как минимум на 11 подтипов (13).Хотя большинство генов cas сильно расходятся и связаны только с определенными локусами CRISPR, cas1 и cas2 заметно консервативны в последовательности в трех основных типах систем CRISPR (2).

Механизм, с помощью которого CRISPR-Cas обеспечивает иммунитет против мобильных генетических элементов, может быть поражен в три этапа: (i) включение вторгающейся последовательности нуклеиновой кислоты в локус CRISPR; (ii) транскрипция и созревание CRISPR-РНК (crRNA); и (iii) вмешательство в мишень со стороны crRNA и белкового комплекса Cas-белков, которое регулируется спариванием оснований crRNA (14,15).Хотя процессы биогенеза и интерференции crRNA хорошо охарактеризованы, механизмы приобретения спейсера остаются плохо изученными. Первой успешной демонстрацией получения спейсера в лабораторных условиях была система Streptococcus thermophilus Type II-A. В этом исследовании было обнаружено добавление новых единиц повтор-спейсер, и новый спейсер идеально соответствовал последовательности вызывающего фага (1). Последующие исследования выявили больше событий приобретения спейсера у разных типов CRISPR-Cas, включая Escherichia coli типа IE (16–18), Pseudomonas aeruginosa типа IF (19), Sulfolobus solfataricus типа IA (20,21), Haloarcula hispanica типа IB (22,23) и Pectobacterium atrosepticum типа IF (24).Анализ приобретения спейсера продемонстрировал, что Cas1 и Cas2 являются белками, необходимыми для адаптации нового спейсера в локусе CRISPR хозяина (17,22,25,26). Смежный с протоспейсером мотив (PAM) эффективного опосредованного протоспейсером приобретения спейсера был идентифицирован в E. coli и H. hispanica (18,23). Более того, др. Мотивы ДНК, такие как лидерные последовательности CRISPR и прайминговые спейсеры, играют важную роль в приобретении спейсеров (17,23,25,27-29). Недавно было обнаружено, что наличие дефектных фагов способствует приобретению спейсера у S.thermophilus (30). Стоит знать Heler et al . проанализировали текущие знания о механизме получения спейсера CRIPSR (31). Хотя регуляция транскрипции массива CRISPR с помощью Cbp1 в генах Sulfolobus (32) и cas в бактериях с помощью циклического рецепторного белка AMP, термостабильного нуклеоид-структурирующего белка (H-NS) и LeuO, регулятора транскрипции LysR-типа (10,33–36), регуляция транскрипции наиболее консервативных генов cas1 и cas2 , которые участвуют в приобретении новых спейсеров, требует многого изучения.

Археон Sulfolobus islandicus REY15A кодирует один модуль адаптации и три модуля интерференции CRISPR, один типа I-A и два типа III-B (37). Система CRISPR-Cas в этом роде недавно была исследована в отношении неспособности ее генов cas для правильной функции CRISPR (38), динамических свойств локусов CRISPR после плазмидного заражения (39) и механизма транскрипционно-зависимой ДНК. интерференция (37). В этом исследовании мы представляем in vivo и in vitro доказательств того, что Csa3a активирует транскрипцию генов cas , которые участвуют в приобретении нового спейсера ( генов cas ), тем самым инициируя приобретение спейсера в обоих локусах CRISPR в С.островной .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и условия роста

Sulfolobus islandicus E233S ( ΔpyrEF ΔlacS ) культивировали в среде SCVy при 78 ° C (40). Электропорацию использовали для трансформации S. islandicus E233S, и трансформанты отбирали на двухслойных пластинах с фитальным гелем, как описано ранее (40). E. coli DH5α и клетки Rosetta использовали для клонирования ДНК и получения рекомбинантного белка.Все штаммы E. coli культивировали при 37 ° C в среде Лурия-Бертани и добавляли ампициллин или канамицин для достижения конечной концентрации 100 мкг / мл или 30 мкг / мл, как требуется.

Общие методы манипуляции с ДНК

Ферменты рестрикции и модификации ДНК были приобретены в New England Biolabs или Fermentas. Плазмидную ДНК экстрагировали из клеток E. coli или Sulfolobus с использованием набора AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (Wujiang, Китай).Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) очищали с использованием набора для очистки Axygen PCR Clean-up Kit, и полосы ДНК, фракционированные из агарозного геля, экстрагировали с использованием набора для экстракции ДНК Axygen. Тотальную ДНК получали из Sulfolobus с использованием набора Axygen Genomic DNA Miniprep Kit. Олигонуклеотиды были синтезированы Invitrogen (Шанхай, Китай) и также использовались для секвенирования ДНК.

Экспрессия и очистка белка

Гены csa3a, csa1, cas1, cas2 и cas4 были амплифицированы из S.islandicus REY15A с использованием праймеров, перечисленных в дополнительной таблице S1, и клонировали в вектор экспрессии pET30a E.coli или вектор экспрессии pSeSD Sulfolobus (41). После амплификации в клеток E. coli DH5α экспрессионные плазмиды трансформировали в клеток E. coli Rosetta или клеток S. islandicus E233S. Для экспрессии белка в E. coli рекомбинантные белки индуцировали при 20 ° C в течение 8 часов путем добавления 0.8 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации. После индукции клетки собирали и обрабатывали ультразвуком. Растворимые белки в супернантантах, собранных центрифугированием при 12 000 × g , очищали с использованием никелевой матрицы. После диализа против 10 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0) белки либо использовали сразу, либо хранили при -80 ° C. Концентрацию белка определяли с использованием набора MicroBCA (Pierce; Rockford, IL, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Зонды для анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) получали с помощью ПЦР или отжига с использованием олигонуклеотидов с одним из 5′-концевых праймеров, меченных биотином (дополнительная таблица S1). Затем продукты очищали электрофорезом в 6% нативном полиакриламидном геле (PAGE). Реакции связывания EMSA (20 мкл), содержащие 10 пмоль меченых биотином зондов и различные концентрации Csa3a, как описано в подписях к рисункам, инкубировали в течение 20 мин при 40 ° C в связывающем буфере (20 мМ Трис-HCl, pH 8 .0, 50 мМ KCl, 5% глицерин, 1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота, 1 мМ дитиотреитол, 5 нг / мкл поли (dI-dC)). Для специфической конкуренции в реакционную смесь добавляли возрастающие количества немеченых специфических зондов. После реакции образцы загружали в 6% нативный гель для ПААГ, забуференный 1 × раствором ТВЕ. Комплексы ДНК-белок разделяли при 100 В в течение 90 мин, а затем переносили на поливинилиденфторидную мембрану (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) с использованием системы Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad).Полосы визуализировали хемилюминесцентным детектированием с использованием прозрачного субстрата Western ECL (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) и устройства визуализации MF-Chemibis 3.2 (DNR; Иерусалим, Израиль).

Анализ футпринтинга ДНКазы I

Анализ футпринтинга ДНКазы I выполняли, как описано ранее (42), с небольшими изменениями. Промоторные последовательности csa1 и cas1 были амплифицированы из геномной ДНК с использованием наборов праймеров csa1 F- csa1 R (от –205 до –3, связанных со стартовым кодоном трансляции) и cas1 F- cas1 R (От –143 до +97) и субклонирован в pMD18T (Такара, Далянь, Китай).Последовательности промоторной ДНК амплифицировали с помощью ПЦР из плазмид pMD18T, несущих csa1 и cas1 промоторных последовательностей, с использованием праймеров либо с 5′-концевым 6-HEX-меченным M13F (для кодирующей цепи), либо с 5′-концом, меченным FAM. M13R (для некодирующей цепи, дополнительная таблица S1) и очищенный с помощью 6% PAGE. В 60 мкл реакционной системе 100 нг меченого фрагмента ДНК связывали с 100 мкг Csa3a (бычий сывороточный альбумин использовался вместо Csa3a в контрольном эксперименте) в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, pH7.4, 10 мМ MgCl 2 , 1 мМ CaCl 2 , 0,4 мМ дитиотреитола, 100 мМ KCl и 5% глицерин и инкубировали в течение 20 мин при 40 ° C. После связывания добавляли 0,03 ед. ДНКазы I, не содержащей РНКаз (Roche, Базель, Швейцария), и давали возможность реагировать в течение 5 мин при 30 ° C. Реакцию останавливали и осаждали этанолом. Образцы анализировали в анализаторе ДНК 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), и электрофореграммы сравнивали с GeneMapper v3.5 (Applied Biosystems).

Анализ иммунопреципитации хроматина

Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) выполняли, как описано ранее (43), с использованием кроличьих поликлональных антител против Csa3a.ДНК из образцов ChIP экстрагировали и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Исходные образцы обрабатывали в соответствии с той же процедурой без добавления антисыворотки и бусинок агарозы с протеином A + G (Beyotime, Пекин, Китай). Восстановленную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, специфичных для промоторов csa1, cas1 и lrs14 (SiRe_0993) (дополнительная таблица S1). Восстановленная ДНК была дополнительно проанализирована с помощью количественной ПЦР. Каждая реакция количественного определения содержала 1 мкл восстановленной ДНК, 1 мкл (10 мкМ) ген-специфических прямых и обратных праймеров (те же праймеры, что и использованные выше) и 10 мкл SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) в конечном итоге. объем 20 мкл.Реакции проводили на LightCycler 480 (Roche, Базель, Швейцария). Количественный анализ промоторной последовательности lrs14 использовали в качестве отрицательного контроля. Условия кПЦР были следующими: 30 секунд активации фермента при 95 ° C, затем денатурирование при 95 ° C в течение 5 секунд и отжиг / удлинение при 60 ° C в течение 20 секунд. Образцы охлаждали до 50 ° C, затем нагревали до 99 ° C и строили кривые плавления. Анализ данных выполнялся с помощью программного обеспечения Roche LightCycler 480 HTC1. Анализ ChIP проводили в трех повторностях.

Конструирование

S. islandicuscsa3a -делеционного мутанта

Метод делеции гена, недавно разработанный для S. islandicus REY15A (44), был использован для нокаута гена csa3a в этом исследовании. Левое плечо последовательности (L-плечо), правое плечо последовательности (R-плечо) и плечо целевого гена (G-плечо) амплифицировали из S. islandicus REY15A с использованием набора праймеров, показанного в дополнительной таблице S1. Последовательность маркерной кассеты, несущая гены pyrEF и lacS , была амплифицирована из Sulfolobus-E.coli челночный вектор pHZ2lacS (40) с использованием праймеров M-F-BamHI и M-R-SalI. Затем все фрагменты были клонированы в вектор pUC19, что дало плазмиду с делецией гена csa3a pDel csa3a (дополнительная фигура S1). Отбор мутантов с делецией csa3a- с использованием этой плазмиды проводили, как описано ранее (44).

Препарат тотальной РНК

Тотальную РНК выделяли из экспоненциально растущих культур Sulfolobus в среде SCVy или среде ACVy для индукции гена csa3a под контролем промотора araS (OD 600 = 0.2), как описано ранее (45). Геномную ДНК в образце тотальной РНК удаляли с помощью ДНКазы I (Roche, Базель, Швейцария).

Анализ с обратной транскрипцией (RT) -PCR и RT-PCR в реальном времени (RT-qPCR)

Для определения ко-транскрипции генов csa1, cas1, cas2 и cas4 используются три ген-специфичных обратных праймера ( cas1 qR, cas2 qR и cas4 qR; дополнительная таблица S1, рисунок 1 ) были использованы для создания кДНК первой цепи из образца общей РНК.Три прямых праймера ( csa1 qF, cas1 qF и cas2 qF; дополнительная таблица S1, рисунок 1) в комбинации с тремя обратными праймерами, перечисленными выше, были использованы для амплификации первых кДНК (рисунок 1). Продукты ПЦР разделяли на 1% агарозном геле. Для ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR) кДНК первой цепи синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MuLV (Promega, Madison, WI, США) и специальных обратных праймеров ( csa1 qR, cas1 qR , cas2 qR и cas4 qR; дополнительная таблица S1).Каждую реакцию количественного определения в реальном времени проводили, как описано выше для анализа ChIP-qPCR, с использованием кДНК первой цепи в качестве матрицы и каждого прямого праймера ( csa1 qF, cas1 qF, cas2 qF, cas4 qF или csa3a qF) в комбинации с обратными праймерами, перечисленными выше, вместе с csa3a qR. Транскрипты гена albA использовали в качестве контроля (45), а значения порога цикла (Ct) контрольного транскрипта albA использовали для нормализации значений Ct csa1, cas1, cas2, cas4 и csa3a расшифровок.

Рисунок 1.

Определение ко-транскрипции генов csa1, cas1, cas2 и cas4 . ( A ) Схема расположения генов csa1 (852 п.н.), cas1 (873 п.н.), cas2 (270 п.н.) и cas4 (528 п.н.). Указаны положения праймеров, которые использовались для ОТ-ПЦР для определения ко-транскрипции. Межгенные области между csa1 и cas1 составляют 42 п.н. и между cas1 и cas2 составляют 110 п.н .; cas2 и cas4 перекрываются.( B ) Фрагменты, полученные в экспериментах RT-PCR, проведенных с праймерами csa1 qF и cas1 qR (дорожка 1, продукт 1016 bp), csa1 qF и cas2 qR (дорожка 2), csa1 qF и cas4 qR (дорожка 3), cas1 qF и cas2 qR (дорожка 4, продукт 1151 bp), cas1 qF и cas4 qR (дорожка 5, продукт 1418 bp) и cas2 qF и cas4 qR (дорожка 6, продукт 376 bp). Лэддер ДНК (Trans 2K plus II) запускали на дорожке L в качестве маркера размера.

Рисунок 1.

Определение котранскрипции генов csa1, cas1, cas2 и cas4 . ( A ) Схема расположения генов csa1 (852 п.н.), cas1 (873 п.н.), cas2 (270 п.н.) и cas4 (528 п.н.). Указаны положения праймеров, которые использовались для ОТ-ПЦР для определения ко-транскрипции. Межгенные области между csa1 и cas1 составляют 42 п.н. и между cas1 и cas2 составляют 110 п.н .; cas2 и cas4 перекрываются.( B ) Фрагменты, полученные в экспериментах RT-PCR, проведенных с праймерами csa1 qF и cas1 qR (дорожка 1, продукт 1016 bp), csa1 qF и cas2 qR (дорожка 2), csa1 qF и cas4 qR (дорожка 3), cas1 qF и cas2 qR (дорожка 4, продукт 1151 bp), cas1 qF и cas4 qR (дорожка 5, продукт 1418 bp) и cas2 qF и cas4 qR (дорожка 6, продукт 376 bp). Лэддер ДНК (Trans 2K plus II) запускали на дорожке L в качестве маркера размера.

Вестерн-блоттинг

Трансформанты Sulfolobus культивировали в среде ACVy для индукции экспрессии гена csa3a под контролем промотора araS . Когда OD 600 достигла 0,2, клетки собирали и обрабатывали ультразвуком. Образцы сырого протеина разделяли с помощью 12% додецилсульфата натрия (SDS) -PAGE, а затем переносили на нейлоновую мембрану с использованием системы Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad; Hercules, CA, USA).Белки-мишени детектировались кроличьими поликлональными антителами против Csa1, Cas1 и Csa3a, а затем связывались меченными пероксидазой хрена козьими антикроличьими антителами (Beyotime, Пекин, Китай). Полосы визуализировали хемилюминесцентным детектированием с использованием прозрачного субстрата Western ECL (Bio-Rad; Hercules, Калифорния, США) и устройства визуализации MF-Chemibis 3.2 (DNR; Иерусалим, Израиль).

ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование лидерной проксимальной области CRISPR

Дикий тип S.islandicus E233S, E233S, несущие пустой вектор экспрессии, и штамм с повышенной экспрессией csa3a культивировали в 10 мл среды ACVy при 78 ° C в течение 10 дней. Образцы каждой культуры (0,1 мл) отбирали каждые 24 ч, и клетки использовали для матрицы ПЦР. Лидерные проксимальные области двух локусов CRISPR были амплифицированы с помощью ПЦР с использованием Taq-полимеразы и прямого праймера CRISPR-F и обратного праймера CRISPR2S5-R для локуса 2; и прямой праймер CRISPR-F и обратный праймер CRISPR1S5-R для локуса 1.Продукты ПЦР разделяли на 2% агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромидом этидия. Полосы большего размера, чем у контрольного образца дикого типа, вырезали из геля и очищали с помощью набора для экстракции ДНК Axygen. Очищенные продукты ПЦР клонировали в Т-вектор (Takara, Далянь, Китай) в соответствии с инструкциями производителя, затем продукты лигирования трансформировали в E. coli DH5α. Плазмиды из отдельных колоний очищали и секвенировали в Invitrogen (Шанхай, Китай).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Совместная транскрипция генов

csa1, cas1, cas2 и cas4 в S.Islandicus

Геном S. islandicus REY15A кодирует одну генную кассету, содержащую csa1 (SiRe_0760), cas1 (SiRe_0761), cas2 (SiRe_0762) и cas4 (SiRe_0762) и cas4 (SiRe_07), в которых cas4 (SiRe_07). и cas2 участвуют в приобретении спейсера у этого архея (Figure 1A). Для исследования функции этих генов cas и регуляции их экспрессии генов была приготовлена ​​общая РНК и изучена совместная транскрипция этих генов.Фрагмент ДНК размером 1016 п.н. амплифицировали с использованием праймеров csa1, qF и cas1 qR из кДНК первой цепи, которые синтезировали с использованием cas1 qR в качестве праймера из общей РНК (рис. 1B). Этот результат показал, что гены csa1 и cas1 транскрибируются совместно под контролем промотора csa1 . Однако никакие продукты ПЦР не были амплифицированы с использованием csa1 qF с cas2 qR или cas4 qR из кДНК первой цепи, которые были синтезированы с использованием праймеров cas2 qR и cas4 qR (рисунок 1B).Этот результат показал, что гены cas2 и cas4 не транскрибируются совместно с csa1 . Интересно, что три фрагмента ДНК (1151 п.н., 1418 п.н. и 376 п.н.) были амплифицированы из кДНК первой цепи с использованием пар праймеров cas1 qF- cas2 qR, cas1 qF- cas4 qR и cas2 qF- cas4 qR, которые были синтезированы с использованием олигонуклеотидов cas2 qR и cas4 qR из тотальной РНК. Эти результаты убедительно указывают на то, что cas1, cas2 и cas4 были котранскрибированы.Эти результаты котранскрипции согласуются с промоторами csa1 и cas1 , контролирующими транскрипцию этого оперона. Таким образом, оперон был назван ассоциированным с адаптацией опероном cas (оперон cas ) в соответствии с комплексом aCas, аннотированным Гарретом и др. . (46).

Csa3a связывает оба промотора

csa1 и cas1 in vivo

Ген csa3a (SiRe_0764), кодирующий предполагаемый регулятор транскрипции, соседствует с опероном cas , но в обратной ориентации в S.islandicus REY15A (рис. 1А). Это согласуется с функцией Csa3a в качестве регулятора транскрипции для генов a cas . Поэтому был проведен анализ ChIP для проверки взаимодействия между Csa3a и промоторами cas . Результаты на фиг. 2А демонстрируют, что Csa3a специфически связывается с промоторами csa1 и cas1 . Более того, продукт ПЦР для промотора lrs14 , гена регулятора транскрипции, не был обнаружен в эксперименте с отрицательным контролем.Образец ДНК, выделенный из анализа ChIP, был количественно определен с помощью ПЦР в реальном времени для промоторов csa1, cas1 и lrs14 . Восстановленная ДНК содержала в ~ 10 раз больше ДНК промоторов csa1 и cas1 , чем контрольного промотора lrs14 (рис. 2В). Результаты подтвердили, что Csa3a связывается с промоторами csa1 и cas1 , что позволяет предположить, что Csa3a участвует в регуляции транскрипции оперона cas .

Рисунок 2. Связывание

In vivo Csa3a с промоторами csa1 и cas1 . ( A ) Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) с использованием антисыворотки против Csa3a. Входные образцы составляли 10 −1 , 10 −2 , 10 −3 и 10 −4 количеств исходных образцов, описанных в разделе «Материалы и методы». ДНК, выделенную из иммунопреципитатов, амплифицировали с праймерами, специфичными для промоторов csa1 и cas1 или промотора lrs14 в качестве контроля.( B ) Результат ChIP-qPCR показал, что промоторных последовательностей csa1 и cas1 в восстановленной ДНК были примерно в 10 раз относительно промоторной последовательности lrs14 .

Рисунок 2.

Связывание in vivo Csa3a с промоторами csa1 и cas1 . ( A ) Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) с использованием антисыворотки против Csa3a. Входные образцы составляли 10 −1 , 10 −2 , 10 −3 и 10 −4 количеств исходных образцов, описанных в разделе «Материалы и методы».ДНК, выделенную из иммунопреципитатов, амплифицировали с праймерами, специфичными для промоторов csa1 и cas1 или промотора lrs14 в качестве контроля. ( B ) Результат ChIP-qPCR показал, что промоторных последовательностей csa1 и cas1 в восстановленной ДНК были примерно в 10 раз относительно промоторной последовательности lrs14 .

Локализация Csa3a-связывающей последовательности в промоторе

csa1

Для изучения регуляции промотора csa1 с помощью Csa3a промотор использовали в качестве зонда в эксперименте EMSA.В промоторе архей гексамерный ТАТА-бокс имеет центр -26 / -27 по отношению к сайту начала транскрипции и BRE (элемент распознавания транскрипционного фактора В), расположенный непосредственно выше ТАТА-бокса. Таким образом, промоторный фрагмент P1 (положения от -205 до -4 относительно стартового кодона трансляции) и два 5′-усеченных элемента P2 (положения от -118 до -4) и P3 (положения от -42 до -4) были использованы в EMSA-эксперимент для определения сайта связывания Csa3a (рис. 3А). И P1, и P2 фрагменты ДНК производили сильные сдвиги полосы с Csa3a на геле, тогда как такая задержанная полоса не наблюдалась, когда фрагмент P3 инкубировали с Csa3a (рис. 3B).Мы сделали вывод, что сайт связывания для Csa3a расположен между положениями -118 и -42 на промоторе csa1 относительно стартового кодона трансляции.

Рисунок 3.

Связывание промотора csa1 in vitro с помощью Csa3a. ( A ) Схематическая диаграмма промотора csa1 и ДНК-зондов, используемых для EMSA. Указаны положения праймеров, используемых для амплификации зондов. ( B ) Эксперименты EMSA с использованием трех усеченных зондов в отсутствие или в присутствии Csa3a (1.6 пмоль / мкл). F: зонд со свободной маркировкой; S: смещенная полоса. ( C ) Анализ футпринтинга ДНКазы I с кодирующими (помеченными HEX, пики над последовательностями промотора) и некодирующими (помеченными FAM, пики ниже промоторной последовательности) цепями ДНК-фрагментов, содержащих промотор csa1 в наличие (красные пики) и отсутствие (синие пики) Csa3a. Защищенные нуклеотиды (относительно стартового кодона трансляции) показаны красным, а минимальная область обведена рамкой. ( D ) Эксперимент с EMSA с использованием последовательности области в рамке, указанной на (C), в качестве зонда с увеличивающимся количеством Csa3a (0.4, 0,8 и 1,6 пмоль / мкл). ( E ) Эксперимент EMSA в присутствии Csa3a (0,4 пмоль / мкл) с использованием того же зонда, что и в (D), с увеличивающимся количеством немеченых нуклеотидов, покрывающих промотор csa1 (молярное соотношение = 1: 1, 1: 4 и 1: 8).

Рисунок 3.

Связывание промотора csa1 in vitro с помощью Csa3a. ( A ) Схематическая диаграмма промотора csa1 и ДНК-зондов, используемых для EMSA. Указаны положения праймеров, используемых для амплификации зондов.( B ) Эксперименты EMSA с использованием трех усеченных зондов в отсутствие или в присутствии Csa3a (1,6 пмоль / мкл). F: зонд со свободной маркировкой; S: смещенная полоса. ( C ) Анализ футпринтинга ДНКазы I с кодирующими (помеченными HEX, пики над последовательностями промотора) и некодирующими (помеченными FAM, пики ниже промоторной последовательности) цепями ДНК-фрагментов, содержащих промотор csa1 в наличие (красные пики) и отсутствие (синие пики) Csa3a. Защищенные нуклеотиды (относительно стартового кодона трансляции) показаны красным, а минимальная область обведена рамкой.( D ) Эксперимент с EMSA с использованием последовательности области в рамке, указанной на (C), в качестве зонда с возрастающими количествами Csa3a (0,4, 0,8 и 1,6 пмоль / мкл). ( E ) Эксперимент EMSA в присутствии Csa3a (0,4 пмоль / мкл) с использованием того же зонда, что и в (D), с увеличивающимся количеством немеченых нуклеотидов, покрывающих промотор csa1 (молярное соотношение = 1: 1, 1: 4 и 1: 8).

Идентификация минимальной области связывания Csa3a в промоторе

csa1

Для определения точной области связывания Csa3a на промоторе csa1 был проведен анализ футпринтинга, и было показано, что область от -81 до -42 обеих цепей промоторной последовательности защищена Csa3a (рис. 3C).Эта последовательность демонстрирует несовершенный инвертированный повтор рядом с блоком BRE и TATA (дополнительный рисунок S2). Затем фрагмент длиной 25 п.н. использовали в качестве зонда в эксперименте EMSA для дальнейшего тестирования ДНК-связывающей способности Csa3a. Результаты показывают, что увеличение количества белка Csa3a усиливает сигнал задержанных полос (рис. 3D) и, более того, что увеличение количества немеченого специфического зонда избирательно снижает сигнал задержанных полос (рис. 3E). Таким образом, эти результаты определяют минимальную область для связывания Csa3a на промоторе csa1 .

Идентификация двух элементов ДНК, необходимых для связывания Csa3a в промоторе

cas1 и прилегающей последовательности

Поскольку Csa3a связывает как csa1 , так и промоторные последовательности cas1 in vivo и csa1 и cas1 транскрибируются отдельно, мы решили проанализировать взаимодействие между промотором cas1 и Csa3a. В области между положениями от -35 до +45 промотора cas1 (относительно стартового кодона трансляции, TTG) и его соседней последовательности были обнаружены два фрагмента ДНК путем выравнивания, которые были аналогичны по последовательности минимальной последовательности, необходимой для Связывание Csa3a с промотором csa1 (рис. 4А).Таким образом, полноразмерная последовательность (P1, от -35 до +45), расположенный выше элемент ДНК (P2, от -35 до -10) и нижестоящий элемент (P3, от +1 до +45) использовались в качестве зондов в EMSA. эксперимент для проверки связывания Csa3a (рис. 4A). При увеличении концентрации Csa3a сигналы задержанных полос P1 становились сильнее, в то время как увеличение количества холодного зонда уменьшало сигналы задержанных полос (рис. 4B). Эти результаты показали, что Csa3a специфически связывается с промотором cas1 и его соседней последовательностью.Однако результаты EMSA показали, что увеличение количества Csa3a не задерживает фрагмент P2 (фиг. 4C) и что Csa3a только слабо связывается с фрагментом P3 (фиг. 4D). Csa3a слабо задерживает P4 и P5 (P4: P1 с делецией элемента P2; P5: P1 с делецией элемента P3), но не задерживает саму внутреннюю последовательность (дополнительный рисунок S3). Таким образом, в отличие от связывания Csa3a с промотором csa1 , для эффективного связывания Csa3a с промотором cas1 требуются как сайты P2 и P3, так и внутренний элемент между P2 и P3.

Рисунок 4.

Идентификация сайта связывания Csa3a на промоторе cas1 и кодирующей последовательности cas1 . ( A ) Схематическая диаграмма промотора cas1 и ДНК-зондов, используемых для EMSA. Стартовый кодон трансляции (TTG) обозначен красным цветом. Указаны положения трех зондов относительно стартового кодона трансляции. Два участка, подобные минимальному сайту связывания Csa3a на промоторе csa1 , заключены в рамку.( B ) Эксперименты EMSA с использованием биотина, меченного P1, в качестве зонда с увеличивающимся количеством Csa3a (0,4, 0,8 и 1,6 пмоль / мкл) или немеченого холодного зонда P1 (молярное соотношение = 1: 1, 1: 4 и 1: 8 ). ( C и D ) Эксперименты EMSA с использованием биотина, меченного P2 или P3, в качестве зонда с увеличивающимися количествами Csa3a (2,4, 4,8, 6 пмоль / мкл). F: зонд со свободной маркировкой; S: смещенная полоса. ( E ) Анализ футпринтинга ДНКазы I с кодирующими (метка HEX, пики над последовательностями промотора) и некодирующими (метка FAM, пики ниже последовательности промотора) цепями фрагментов ДНК, содержащих промотор cas1 в наличие (красные пики) и отсутствие (черные пики) Csa3a.Защищенные нуклеотиды (относительно стартового кодона трансляции) показаны красным, а области, подобные сайту связывания Csa3a на промоторе csa1 , заключены в рамку.

Рисунок 4.

Идентификация сайта связывания Csa3a на промоторе cas1 и кодирующей последовательности cas1 . ( A ) Схематическая диаграмма промотора cas1 и ДНК-зондов, используемых для EMSA. Стартовый кодон трансляции (TTG) обозначен красным цветом. Указаны положения трех зондов относительно стартового кодона трансляции.Два участка, подобные минимальному сайту связывания Csa3a на промоторе csa1 , заключены в рамку. ( B ) Эксперименты EMSA с использованием биотина, меченного P1, в качестве зонда с увеличивающимся количеством Csa3a (0,4, 0,8 и 1,6 пмоль / мкл) или немеченого холодного зонда P1 (молярное соотношение = 1: 1, 1: 4 и 1: 8 ). ( C и D ) Эксперименты EMSA с использованием биотина, меченного P2 или P3, в качестве зонда с увеличивающимися количествами Csa3a (2,4, 4,8, 6 пмоль / мкл). F: зонд со свободной маркировкой; S: смещенная полоса. ( E ) Анализ футпринтинга ДНКазы I с кодирующими (метка HEX, пики над последовательностями промотора) и некодирующими (метка FAM, пики ниже последовательности промотора) цепями фрагментов ДНК, содержащих промотор cas1 в наличие (красные пики) и отсутствие (черные пики) Csa3a.Защищенные нуклеотиды (относительно стартового кодона трансляции) показаны красным, а области, подобные сайту связывания Csa3a на промоторе csa1 , заключены в рамку.

Анализ футпринтинга с использованием фрагмента, охватывающего положения от -143 до +97 промоторной последовательности cas1 , выполняли для определения точных сайтов связывания Csa3a. Csa3a защищал большую область фрагмента, простирающуюся от положения -35 до +45 (рис. 4E). Защищенная область содержала два элемента, которые очень похожи на Csa3a-защищенную последовательность на промоторе csa1 (рисунок 4E и дополнительный рисунок S2).Было обнаружено, что ни один из сайтов сам по себе не является достаточным для связывания Csa3a (фиг. 4C и D), но, по-видимому, эти две области действуют совместно, облегчая распознавание Csa3a.

Сверхэкспрессия

csa3a -активированной транскрипции генов cas

Хотя специфическое связывание in vitro и in vivo Csa3a с промотором csa1 или cas1 было подтверждено, специфический механизм регуляции транскрипции оперона cas оставался неясным.Таким образом, мы сконструировали мутант с делецией гена csa3a csa3a , фиг. 5A) и штамм со сверхэкспрессией csa3a- (OE csa3a ) (фиг. 5A). Затем тестировали экспрессию генов csa3a, csa1, cas1, cas2 и cas4 в штаммах дикого типа (несущих пустой вектор pSeSD), Δ csa3a и OE csa3a . Штаммы Sulfolobus выращивали в среде ACVy до OD 600 = 0,2, затем клетки собирали и готовили образцы общей РНК и сырого белка.Транскрипты генов a cas определяли методом RT-qPCR с использованием мРНК гена albA в качестве внутреннего контроля (45). Уровень транскрипции csa3a в штамме OE csa3a увеличился в 489 (± 105) раз по сравнению со штаммом дикого типа, а в штамме Δ csa3a кДНК не обнаружена. Уровни транскрипции генов cas были снижены в 1,00 (± 0,18) -, 0,62 (± 0,08) -, 0,84 (± 0,27) — и 0,94 (± 0,16) раза в штамме Δ csa3a и увеличены на 6279 (± 1583) -, 3331 (± 273) -, 1291 (± 481) и 525 (± 79) раз в штамме OE csa3a по сравнению с экспрессией в штамме дикого типа (рис. 5B).Csa3a не был обнаружен ни в штаммах дикого типа, ни в штаммах Δ csa3a в анализе вестерн-блоттинга, в то время как сильная полоса белка Csa3a из штамма OE csa3a была визуализирована на мембране (рис. 5C). Белки Csa1 и Cas1 показали повышенную экспрессию в штамме OE csa3a , а уровни экспрессии в штамме Δ csa3a были аналогичны таковым в штамме дикого типа (рис. 5C). Этот результат показал, что Csa3a действует как активатор транскрипции для оперона cas .Однако белки Cas2 и Cas4 не были обнаружены в штаммах дикого типа, Δ csa3a или OE csa3a с помощью вестерн-блоттинга, что соответствует низким уровням белка в клетках. PCNA3 использовали в качестве внутреннего контроля при вестерн-блоттинге, и его экспрессия не показала различий среди штаммов дикого типа, Δ csa3a и OE csa3a . Эти результаты ясно показали, что регулятор Csa3a действует как активатор транскрипции для генов cas в S.islandicus ; однако трансляция мРНК cas может контролироваться неизвестным механизмом.

Рисунок 5.

Влияние Csa3a на экспрессию ac как генов . ( A ) ПЦР-проверка мутанта csa3a -делеции. Продукты ПЦР, полученные с использованием специфических праймеров, расположенных выше и ниже гена csa3a из геномной ДНК Sulfolobus islandicus E233S (дикого типа) и штамма csa3a -делеции (Δ csa3a ).Лестницу ДНК проводили на дорожке L в качестве маркера размера. ( B ) Относительные уровни транскрипции csa3a, csa1, cas1, cas2 и cas4 при сверхэкспрессии S. islandicus csa3a- (OE csa3a ) и csa3a -делеция csa (Δ3a ) после нормализации до уровня S. islandicus E233S (дикого типа), несущего пустой вектор pSeSD. ( C ) Вестерн-блоттинг уровней экспрессии белков Csa3a, Csa1 и Cas1 в S.islandicus E233S (дикий тип), csa3a со сверхэкспрессией (OE csa3a ) и csa3a -делецией (Δ csa3a ). Антисыворотку против PCNA3 использовали в качестве контроля загрузки.

Рисунок 5.

Влияние Csa3a на экспрессию ac как генов . ( A ) ПЦР-проверка мутанта csa3a -делеции. Продукты ПЦР, полученные с использованием специфических праймеров, расположенных выше и ниже гена csa3a из геномной ДНК Sulfolobus islandicus E233S (дикого типа) и штамма csa3a -делеции (Δ csa3a ).Лестницу ДНК проводили на дорожке L в качестве маркера размера. ( B ) Относительные уровни транскрипции csa3a, csa1, cas1, cas2 и cas4 при сверхэкспрессии S. islandicus csa3a- (OE csa3a ) и csa3a -делеция csa (Δ3a ) после нормализации до уровня S. islandicus E233S (дикого типа), несущего пустой вектор pSeSD. ( C ) Вестерн-блоттинг уровней экспрессии белков Csa3a, Csa1 и Cas1 в S.islandicus E233S (дикий тип), csa3a со сверхэкспрессией (OE csa3a ) и csa3a -делецией (Δ csa3a ). Антисыворотку против PCNA3 использовали в качестве контроля загрузки.

Активация

de novo Получение спейсера сверхэкспрессией csa3a

дикого типа ( S. islandicus E233S), E233S, несущий пустой вектор экспрессии, и штаммов с повышенной экспрессией csa3a , культивировали в среде ACVy, и последний штамм показал замедленный рост с начала инокуляции (данные не показаны).Более крупные фрагменты ДНК, амплифицированные между лидерной последовательностью и спейсером 5 локусов 1 и 2, наблюдались через 1 день инкубации в среде (фигура 6A). Два больших фрагмента были получены с помощью ПЦР, причем сильная полоса содержала один спейсер de novo , а слабая полоса несла два спейсера для обоих локусов CRISPR (рис. 6А). Не было обнаружено расширенных полос от E233S и E233S, несущих пустой вектор.

Рис. 6.

Csa3a запускает получение спейсера CRISPR в Sulfolobus .( A ) Приобретение спейсера было обнаружено с помощью ПЦР для обоих локусов в штамме со сверхэкспрессией csa3a . C1: S. islandicus штамм E233S, C2: E233S, несущий пустой вектор pSeSD, OE csa3a : E233S, несущий плазмиду сверхэкспрессии csa3a . Показана экспрессионная плазмида csa3a с указанными отдельными генами ( B и C ). Расположение протоспейсеров, соответствующих вновь приобретенным спейсерам, полученным из плазмиды, в локусе 1 (B) и локусе 2 (C) показано во внутреннем (прямая цепь) и внешнем (обратная цепь) кругах.

Рис. 6.

Csa3a запускает получение спейсера CRISPR в Sulfolobus . ( A ) Приобретение спейсера было обнаружено с помощью ПЦР для обоих локусов в штамме со сверхэкспрессией csa3a . C1: S. islandicus штамм E233S, C2: E233S, несущий пустой вектор pSeSD, OE csa3a : E233S, несущий плазмиду сверхэкспрессии csa3a . Показана экспрессионная плазмида csa3a с указанными отдельными генами ( B и C ).Расположение протоспейсеров, соответствующих вновь приобретенным спейсерам, полученным из плазмиды, в локусе 1 (B) и локусе 2 (C) показано во внутреннем (прямая цепь) и внешнем (обратная цепь) кругах.

ДНК из более крупных продуктов ПЦР клонировали и трансформировали в E. coli и секвенировали ДНК из отдельных колоний. Это выявило большое количество спейсерных последовательностей de novo в каждом локусе (все протоспейсеры суммированы в дополнительной таблице S2). Для локуса 1 было получено 52 уникальных спейсера с 96.1% спейсеров из экспрессионной плазмиды csa3a и 3,9% из геномной ДНК. Для локуса 2 было приобретено 108 уникальных спейсеров, причем 91,7% спейсеров были получены из плазмидной ДНК, а остальные — из геномной ДНК. Большинство колоний несли только один новый приобретенный уникальный спейсер, соседний с лидерной последовательностью, и в 15 колониях было обнаружено два, а в одной колонии было обнаружено четыре спейсера de novo (Таблица 1). Расположение этих новых спейсеров не показало значительного отклонения в отношении генов белков или межгенных последовательностей.Однако не было обнаружено, что спейсер происходит от гена csa3a в экспрессионной плазмиде, что может отражать то, что штаммы, приобретенные спейсеры из csa3a , будут нацелены на другую копию этого гена в своем собственном геноме, таким образом, выжившие штаммы, несущие новый спейсер из csa3a Последовательность гена была обнаружена (рис. 6B и C) (47). Было обнаружено, что всего 11 спейсеров происходят из генома хозяина. Два протоспейсера соответствовали гену SiRe_0056 (ген нуклеозидгидролазы, предпочитающему инозин / уридин), и два совпадали с геном SiRe_1054 (ген белка, связанного с аденилаткиназой).Каждый протоспейсер соответствовал SiRe_0560 (суперсемейство главного фасилитатора MFS_1), SiRe_0654 (ген белка связывающего железо-сера домена ферредоксина 4Fe-4S), SiRe_1500, SiRe_1555 (ген фактора инициации транскрипции TFIIB), SiRe_2286 (суперсемейство главного фасилитатора MFS_1) (malate дегидрогеназа) и SiRe_2393 (механочувствительный ионный канал) соответственно. Не было доказательств смещенной направленности цепи для приобретенных спейсеров обоих локусов (Рисунок 6B и C; Таблица 1). Более того, последовательность CCN PAM была консервативной в соседних с последовательностями протоспейсеров, и -1 сайт PAM был смещен в сторону A (таблица 1), что согласуется с предыдущим исследованием на Sulfolobus (21).

Анализ протоспейсеров
Таблица 1.

Анализ протоспейсеров

Геномная ДНК CCN 3 9034 . Геномная ДНК Таблица 1.3595 Анализ таблицы протоспейсеры

. Локус 1 . Локус 2 .
Расположение протоспейсера
Всего 52 108
Плазмида 50 (96,1%) 99 (91,7%) 2
9%) 9 (8,3%)
Прямая прядь 28 (53,8%) 60 (55,6%)
Обратная прядь 24 (46,2%) 48 (44,4%)
Внутри гена белка 40 (76,9%) 72 (66,7%)
Межгенный 12 (23,1%) 36 (33,3%)
Последовательности PAM
35 (67,3%) 80 (74.1%)
CCA 12 (23,1%) 35 (32,4%)
CCT 12 (23,1%) 20 (18,5%)
CCG 6 ( 11,5%) 15 (13,9%)
CCC 5 (9,6%) 10 (9,3%)
Нет PAM 17 (32,7%) 28 (25,9%)
Вставка одинарной и множественной проставки
Одиночная 42 84
Два 3 12
Четыре 1
Локус 1 . Локус 2 .
Расположение протоспейсера
Всего 52 108
Плазмида 50 (96,1%) 99 (91,7%) 2
% ) 9 (8,3%)
Прямая прядь 28 (53,8%) 60 (55,6%)
Обратная прядь 24 (46.2%) 48 (44,4%)
Внутри гена белка 40 (76,9%) 72 (66,7%)
Межгенное 12 (23,1%) 36 (33,3%)
последовательности PAM
CCN 35 (67,3%) 80 (74,1%)
CCA 12 (23,1%) 35 (32,4%)
12 (23,1%) 20 (18,5%)
CCG 6 (11.5%) 15 (13,9%)
CCC 5 (9,6%) 10 (9,3%)
Нет PAM 17 (32,7%) 28 (25,9%)
Вставка одинарной и множественной проставки
Одиночный 42 84
Два 3 12
Четыре 1
Геномная ДНК 3 9034 . Геномная ДНК
. Локус 1 . Локус 2 .
Расположение протоспейсера
Всего 52 108
Плазмида 50 (96,1%) 99 (91,7%) 2
% ) 9 (8,3%)
Прямая прядь 28 (53,8%) 60 (55,6%)
Обратная прядь 24 (46.2%) 48 (44,4%)
Внутри гена белка 40 (76,9%) 72 (66,7%)
Межгенное 12 (23,1%) 36 (33,3%)
последовательности PAM
CCN 35 (67,3%) 80 (74,1%)
CCA 12 (23,1%) 35 (32,4%)
12 (23,1%) 20 (18,5%)
CCG 6 (11.5%) 15 (13,9%)
CCC 5 (9,6%) 10 (9,3%)
Нет PAM 17 (32,7%) 28 (25,9%)
Вставка одинарной и множественной проставки
Одиночная 42 84
Два 3 12
Четыре 1
Локус 1 . Локус 2 .
Расположение протоспейсера
Всего 52 108
Плазмида 50 (96,1%) 99 (91,7%) 2
% ) 9 (8,3%)
Прямая прядь 28 (53,8%) 60 (55,6%)
Обратная прядь 24 (46.2%) 48 (44,4%)
Внутри гена белка 40 (76,9%) 72 (66,7%)
Межгенное 12 (23,1%) 36 (33,3%)
последовательности PAM
CCN 35 (67,3%) 80 (74,1%)
CCA 12 (23,1%) 35 (32,4%)
12 (23,1%) 20 (18,5%)
CCG 6 (11.5%) 15 (13,9%)
CCC 5 (9,6%) 10 (9,3%)
Нет PAM 17 (32,7%) 28 (25,9%)
Вставка одинарной и множественной проставки
Одиночный 42 84
Два 3 12
Четыре 1
9

В этих экспериментах мы исследовали регуляцию транскрипции оперона cas , содержащего генов cas1 и cas2 , с помощью CRISPR-Cas-специфического регулятора Csa3a как in vivo , так и in vitro .Ген csa3 также называется csx1 и делится на подтип III-U (2). Гены csx1 часто обнаруживаются физически связанными с кассетами генов архей cmr , однако они также появляются в модулях типа I, что предполагает более широкую роль этого гена (37,48). Предполагается, что белок Csa3a имеет N-концевой домен неизвестной функции, слитый с C-концевым MarR-подобным доменом крылатой спирали-поворот-спираль, что позволяет предположить, что он функционирует как регулятор транскрипции.Кристаллическая структура Csa3 из S. solfataricus P2 (Mw = 27,8 кДа), которая тесно связана с Csa3a из S. islandicus REY15A (идентичность 66%), была недавно решена (49). Наши результаты продемонстрировали, что сверхэкспрессия csa3a инициировала получение спейсера de novo в системе CRISPR-Cas типа I-A Sulfolobus . Более того, было показано, что Csa3a связывается с несовершенной палиндромной последовательностью (TTCNTAACTAAANANGGNNNGAAA, дополнительная фигура S2A) перед промотором csa1 или двумя аналогичными элементами, покрывающими BRE и TATA-бокс промотора cas1 и стартовый кодон трансляции.Сверхэкспрессия csa3a значительно увеличивала уровень транскрипции и умеренно повышала уровень трансляции генов cas , демонстрируя, что Csa3a действует как активатор транскрипции. Csa3a может регулировать транскрипцию других генов и даже локусов CRISPR, однако это требует дальнейшего подтверждения. Сайт связывания Csa3a на промоторе csa1 представляет собой типичный активационный цис- -элемент в архее, расположенный непосредственно выше основных промоторных элементов (дополнительный рисунок S2B), и связывающие белки привлекают общие факторы транскрипции для активации транскрипции (50).Два сайта связывания Csa3a на промоторе cas1 , покрывающем ТАТА-бокс, BRE и стартовый кодон трансляции (дополнительный рисунок S2B), представляют атипичный механизм активации транскрипции. Однако данные in vivo предполагают, что Csa3a активирует транскрипцию гена cas1 (рис. 5B и C). Наши результаты также согласуются с транскриптомными данными S. islandicus LAL 14/1, в которых повышающая регуляция оперона cas сопровождалась повышением уровней транскрипта csa3a после инфицирования рудивирусом (48).Эти результаты предполагают, что csa3a было транскрибировано на низком уровне до заражения вирусом, тогда как после заражения повышенные уровни Csa3a могут активировать транскрипцию генов cas . Действительно, Csa3a не был обнаружен в штамме дикого типа с помощью вестерн-блоттинга, и мы также подтвердили, что сила промоторов как csa1 , так и промоторов cas1 была очень низкой (∼10 -6 раз) по сравнению с промотором промотор araS (50) (дополнительный рисунок S2C).Таким образом, мы делаем вывод, что низкий уровень транскрипции гена csa3a вызвал низкую активность экспрессии оперона cas .

Ранее сообщалось, что вирусная инфекция может вызвать приобретение спейсера. Например, монокаудавирус SMV1 вызвал приобретение спейсера из коинфекционных геномов pMGB1 и STSV2 у Sulfolobus (20,21), а приобретение спейсера, опосредованного праймингом, наблюдалось у H. hispanica (22), E. coli (16, 25,29) и P.atrosepticum (24). Также сообщалось, что сверхэкспрессия Cas1 и Cas2 может способствовать приобретению спейсера в E. coli (17,25). Однако основной механизм, с помощью которого комплекс aCas активируется для адаптации, остается неизвестным. В этом исследовании сверхэкспрессия гена csa3a на плазмиде сильно активировала транскрипцию оперона cas , но уровень трансляции оперона acas был повышен в меньшей степени, чем уровень транскрипции (Рисунок 5B).Наиболее важно то, что мы наблюдали, что сверхэкспрессия гена csa3a эффективно запускает приобретение спейсера de novo . Таким образом, мы продемонстрировали, что регулятор транскрипции Csa3a играет решающую роль в этом пути, и модель этого процесса предложена на рисунке 7: шаг 1: инвазия вируса или других мобильных генетических элементов индуцирует экспрессию гена регулятора транскрипции; шаг 2: регулятор в значительной степени активирует транскрипцию оперона cas , включая cas1 и cas2 ; Шаг 3: Cas1, Cas2 и другие белки Cas, образующие комплекс aCas, захватывают новые спейсеры из ДНК захватчика.Первый шаг был подтвержден в S. islandicus LAL 14/1, что ген csa3a был индуцирован на поздней стадии после заражения вирусом. Однако гены cas были индуцированы незначительно на ранней стадии, что может указывать на то, что другие факторы, но не Csa3a, также участвовали в индукции cas . Как бы то ни было, для этого штамма после заражения вирусом не наблюдалось приобретения спейсера de novo (48). Увеличение транскрипции csa3a и cas было намного выше в нашем исследовании.Это предполагает, что для эффективной активации генов cas требуется пороговое значение индукции csa3a . Наша модель предполагает далее, что Cas1- и Cas2-зависимый процесс получения спейсера имеет такую ​​же высокую эффективность, как и процесс прайминга, как сообщалось ранее для других архей или бактерий (22,25). В нашей модели процесс приобретения спейсера de novo должен в значительной степени активироваться регулятором транскрипции, который может ощущать вторжение генетических элементов.

Рисунок 7.

Модель приобретения спейсера CRISPR de novo , опосредованная регулятором транскрипции и зависимая от Cas1- + Cas2. ( A ) Во время заражения вирусом и другими генетическими мобильными элементами регулятор транскрипции обнаруживает захватчика, и его экспрессия активируется. ( B ) Регулятор сильно активирует транскрипцию генов cas , включая cas1 и cas2 . ( C ) Cas1, Cas2 и другие белки Cas (возможны Cascade и Cas3) вместе распознают последовательности PAM протоспейсера в ДНК захватчика, и спейсеров de novo вставляют в локус CRISPR рядом с лидерной последовательностью.

Рис. 7.

Модель приобретения спейсера CRISPR de novo , опосредованная регулятором транскрипции и зависимая от Cas1- + Cas2. ( A ) Во время заражения вирусом и другими генетическими мобильными элементами регулятор транскрипции обнаруживает захватчика, и его экспрессия активируется. ( B ) Регулятор сильно активирует транскрипцию генов cas , включая cas1 и cas2 . ( C ) Cas1, Cas2 и другие белки Cas (возможны Cascade и Cas3) вместе распознают последовательности PAM протоспейсера в ДНК захватчика, и спейсеров de novo вставляют в локус CRISPR рядом с лидерной последовательностью.

Наши результаты также указывают на то, что сильно индуцированный Cas1- и Cas2-зависимый процесс приобретения спейсера зависит от последовательности PAM протоспейсеров (таблица 1), но не так строг, как это наблюдалось при приобретении индуцированного вирусом SMV1 спейсера (51 ). Более того, для штамма E. coli CRISPR-Cas minus сообщалось, что сверхэкспрессия генов cas1 и cas2 привела к получению de novo спейсера от протоспейсера с менее консервативной последовательностью PAM (17).Следовательно, мы делаем вывод, что белок Cas, отличный от Cas1 и Cas2, ответственен за распознавание PAM, и что повышенный уровень белков Cas1 и Cas2 приводит к приобретению спейсера от протоспейсеров с менее консервативной последовательностью PAM.

Мы благодарим профессора Роджера Гарретта из Датского центра архей в Университете Копенгагена за критическое прочтение рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальный фонд естественных наук Китая [31100050 — N.P., 31128011 — Q.С. и Ю. Л.]. Финансирование платы за открытый доступ: Национальный фонд естественных наук Китая [31100050 и 31128011].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.,,,,,,,.

CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот

,

Science

,

2007

, vol.

315

(стр.

1709

1712

) 2.,,,,,,,,, И др.

Развитие и классификация систем CRISPR-Cas

,

Nat.Rev. Microbiol.

,

2011

, т.

9

(стр.

467

477

) 3.,,.

CRISPR — широко распространенная система, обеспечивающая приобретенную устойчивость к фагам у бактерий и архей

,

Nat. Rev Microbiol.

,

2008

, т.

6

(стр.

181

186

) 4.,,,.

Промежуточные последовательности регулярно расположенных прокариотических повторов происходят от чужеродных генетических элементов

,

J. Mol. Evol.

,

2005

, т.

60

(стр.

174

182

) 5.,,.

Эволюционная консервация последовательностей и вторичных структур в CRISPR-повторах

,

Genome Biol.

,

2007

, т.

8

стр.

R61

6.,,. Элементы

CRISPR в Yersinia pestis приобретают новые повторы за счет преимущественного поглощения ДНК бактериофага и предоставляют дополнительные инструменты для эволюционных исследований

,

Microbiology

,

2005

, vol.

151

(стр.

653

663

) 7.,,,.

Кластерные регулярно расположенные короткие повторы палиндрома (CRISPR) имеют спейсеры внехромосомного происхождения

,

Microbiology

,

2005

, vol.

151

(стр.

2551

2561

) 8.,,.

Распределение совпадений спейсеров CRISPR в вирусах и плазмидах ацидотермофилов кренархей и влияние на их механизм ингибирования

,

Biochem. Soc. Пер.

,

2009

, т.

37

(стр.

23

28

) 9.,,,,.

Предполагаемая иммунная система прокариот, основанная на РНК-интерференции: компьютерный анализ предсказанного ферментативного механизма, функциональные аналогии с эукариотическими РНКи и гипотетические механизмы действия

,

Biol. Прямой.

,

2006

, т.

1

стр.

7

10.,,,,,.

Профиль транскрипции систем CRISPR Thermus thermophilus после фаговой инфекции

,

J.Мол. Биол.

,

2010

, т.

395

(стр.

270

281

) 11.,,,,,,.

Транскрипция, обработка и функция кассет CRISPR в Escherichia coli

,

Mol. Microbiol.

,

2010

, т.

77

(стр.

1367

1379

) 12.,,,.

Группа из 45 семейств CRISPR-ассоциированных (Cas) белков и множества подтипов CRISPR / Cas существует в геномах прокариот

,

PLoS Comp.Биол.

,

2005

, т.

1

стр.

e60

13.,.

CRISPR-Cas: эволюция системы адаптивного иммунитета на основе РНК у прокариот

,

RNA Biol.

,

2013

, т.

10

(стр.

679

686

) 14.,,,,,,,,,.

Малые РНК CRISPR направляют противовирусную защиту прокариот

,

Science

,

2008

, vol.

321

(стр.

960

964

) 15.,,,,,.

CRISPR, они меняются: как прокариоты генерируют адаптивный иммунитет

,

Annu. Преподобный Жене.

,

2012

, т.

46

(стр.

311

339

) 16.,,,.

Интерференция CRISPR направляет получение спейсера, специфичного для прядей

,

PLoS One

,

2012

, vol.

7

стр.

e35888

17.,,.

Белки и элементы ДНК, необходимые для процесса адаптации CRISPR в Escherichia coli

,

Nucleic Acids Res.

,

2012

, т.

40

(стр.

5569

5576

) 18.,,,,,.

мотивов ДНК, определяющих эффективность адаптации в массиве Escherichia coli CRISPR

,

Proc. Natl. Акад. Sci. США

,

2013

, т.

110

(стр.

14396

14401

) 19.,,,,.

Адаптивная иммунная система CRISPR / Cas Pseudomonas aeruginosa обеспечивает устойчивость к естественным и сконструированным фагам

,

J.Бактериол.

,

2012

, т.

194

(стр.

5728

5738

) 20.,.

Селективное и гиперактивное поглощение чужеродной ДНК адаптивными иммунными системами архей посредством двух различных механизмов

,

Mol. Microbiol.

,

2012

, т.

85

(стр.

1044

1056

) 21.,,.

Межвирусные конфликты, связанные с использованием иммунной системы CRISPR хозяина Sulfolobus

,

Mol. Microbiol.

,

2014

, т.

91

(стр.

900

917

) 22.,,,.

Адаптация системы Haloarcula hispanica CRISPR-Cas к очищенному вирусу строго требует процесса прайминга.

,

Nucleic Acids Res.

,

2014

, т.

42

(стр.

2483

2492

) 23.,,.

Haloarcula hispanica CRISPR аутентифицирует PAM целевой последовательности для первичной дискриминационной адаптации

,

Nucleic Acids Res.

,

2014

, т.

42

(стр.

7226

7235

) 24.,,,,,,,,.

Праймирование в системе CRISPR-Cas типа I-F запускает независимое от цепей получение спейсера в двух направлениях от праймированного протоспейсера

,

Nucleic Acids Res

,

2014

, vol.

42

(стр.

8516

8526

) 25.,,,,,.

Молекулярная память о перенесенных инфекциях активирует систему адаптивного бактериального иммунитета CRISPR / Cas

,

Nat.Commun.

,

2012

, т.

3

стр.

945

26.,,,,.

Обнаружение и характеристика промежуточных продуктов интеграции спейсера в системе CRISPR-Cas типа I-E

,

Nucleic Acids Res.

,

2014

, т.

42

(стр.

7884

7893

) 27.,,,,,,,,.

Праймирование в системе CRISPR-Cas типа I-F запускает независимое от цепей получение спейсера в двух направлениях от праймированного протоспейсера

,

Nucleic Acids Res.

,

2014

, т.

42

(стр.

8516

8526

) 28.,,,,. Репортерные плазмиды интеграции CRISPR-спейсера

выявляют различные подлинные специфичности приобретения среди вариантов CRISPR-Cas I-E Escherichia coli

,

РНК Biol.

,

2013

, т.

10

(стр.

792

802

) 29.,,,,,,,.

Вырожденные сайты-мишени опосредуют быструю праймированную адаптацию CRISPR

,

Proc.Natl. Акад. Sci. США

,

2014

, т.

111

(стр.

1629

1638

) 30.,,.

Адаптация в бактериальном иммунитете CRISPR-Cas может быть вызвана дефектными фагами

,

Nat. Commun.

,

2014

, т.

5

стр.

4399

31.,,.

Адаптация к новым угрозам: генерация памяти иммунными системами CRISPR-Cas

,

Mol. Microbiol.

,

2014

, т.

93

(стр.

1

9

) 32.,,,,.

Модуляция транскрипции локуса CRISPR с помощью связывающего повтора белка Cbp1 в Sulfolobus

,

Nucleic Acids Res.

,

2012

, т.

40

(стр.

2470

2480

) 33.,,,,,.

Активация транскрипции, опосредованная белком рецептора циклического АМФ из Thermus thermophilus HB8

,

J. Bacteriol.

,

2007

, т.

189

(стр.

3891

3901

) 34.,,,,,.

Идентификация и характеристика промоторов CRISPR-cas E. coli и их подавление с помощью H-NS

,

Mol. Microbiol.

,

2010

, т.

75

(стр.

1495

1512

) 35.,,,,,,,,, И др.

H-NS-опосредованная репрессия иммунитета на основе CRISPR в Escherichia coli K12 может быть ослаблена активатором транскрипции LeuO

,

Mol. Microbiol.

,

2010

, т.

77

(стр.

1380

1393

) 36.,,,,,,,.

Иммунная система CRISPR / Cas представляет собой оперон, регулируемый LeuO, H-NS и лейцин-чувствительным регуляторным белком в сероваре Salmonella enterica Typhi

,

J. Bacteriol.

,

2011

, т.

193

(стр.

2396

2407

) 37.,,,,.

Новый интерференционный механизм модуля CRISPR-Cmr типа IIIB в Sulfolobus

,

Mol.Microbiol.

,

2013

, т.

87

(стр.

1088

1099

) 38.,,,,,.

Генетические детерминанты нацеливания на PAM-зависимую ДНК и процессинга пре-crРНК у Sulfolobus islandicus

,

РНК Biol.

,

2013

, т.

10

(стр.

738

748

) 39.,,,,,,.

Динамические свойства систем Sulfolobus CRISPR / Cas и CRISPR / Cmr при заражении векторными вирусными и плазмидными генами и протоспейсерами

,

Mol.Microbiol.

,

2011

, т.

79

(стр.

35

49

) 40.,,,,.

Немаркированная делеция гена и система вектор-хозяин для гипертермофильного кренархея Sulfolobus islandicus

,

Extremophiles

,

2009

, vol.

13

(стр.

735

746

) 41.,,,,,,,.

Синтетический промотор, индуцируемый арабинозой, обеспечивает высокие уровни экспрессии рекомбинантного белка у гипертермофильных архей Sulfolobus islandicus

,

Прил.Environ. Microbiol.

,

2012

, т.

78

(стр.

5630

5637

) 42.,,,,,.

Sulfolobus solfataricus radA paralogue sso0777 является индуцируемым повреждением ДНК и положительно регулируется белком Sta1

,

Nucleic Acids Res.

,

2007

, т.

35

(стр.

6788

6797

) 43.,,,,,,,,, И др.

Специфичность и функция белков инициатора репликации архейной ДНК

,

Cell Rep.

,

2013

, т.

3

(стр.

485

496

) 44.,,,,,,.

Выявление существенности множественных генов архей pcna с использованием анализа мутантного размножения на основе улучшенного метода нокаута

,

Microbiology

,

2010

, vol.

156

(стр.

3386

3397

) 45.,,,,,,,.

Инициаторный элемент Sulfolobus вносит важный вклад в силу промотора

,

Дж.Бактериол.

,

2013

, т.

195

(стр.

5216

5222

) 46.,,.

Archaeal Иммунная система на основе CRISPR: сменные функциональные модули

,

Trends Microbiol.

,

2011

, т.

19

(стр.

549

556

) 47.,,,.

In vivo активность CRISPR-опосредованной защиты вируса в гипертермофильной архее

,

Мол. Microbiol.

,

2011

, т.

80

(стр.

481

491

) 48.,,,,,,,,, И др.

Массивная активация генов защиты архей во время вирусной инфекции

,

J. Virol.

,

2013

, т.

87

(стр.

8419

8428

) 49.,,,,,,,.

Структура CRISPR-ассоциированного белка Csa3 дает представление о регуляции системы CRISPR / Cas

,

J. Mol. Биол.

,

2011

, т.

405

(стр.

939

955

) 50.,,,,.

Активационный элемент, расположенный выше по течению, вызывающий дифференциальную активацию транскрипции на промоторе архей

,

Mol. Microbiol.

,

2009

, т.

74

(стр.

928

939

) 51.,,,.

Мотивы узнавания Protospacer: смешанная идентичность и функциональное разнообразие

,

РНК Biol.

,

2013

, т.

10

(стр.

891

899

)

© Автор (ы) 2015.Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии оригинальная работа правильно процитирована.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *