Список групп мглу: Бакалавриат и специалитет

Содержание

Сотрудники Французского университетского колледжа в Москве

Организация

В России существуют два Французских университетских колледжа: один в Москве, основанный в 1991 году, другой — в Санкт-Петербурге, основанный в 1992 году.

Президент Французских университетских колледжей

Марек ХАЛЬТЕР

Научный совет Французских университетских колледжей

возглавляет профессор Мари-Пьер РЕ

Директор Французского университетского колледжа в Москве

Люк ОБРИ

Исполнительный директор Французского университетского колледжа в Москве

Роман Александрович МАТАСОВ

Ассистент директора Французского университетского колледжа в Москве

Александра Андреевна ЖЕГУЛЬСКАЯ

Преподаватели (франкоязычное отделение)

ИСТОРИЯ

ЛИТЕРАТУРА

ПРАВО

СОЦИОЛОГИЯ

ФИЛОСОФИЯ

 

Преподаватели (русскоязычное отделение)

ПРАВО

  • Алим Хусейнович УЛЬБАШЕВ (МГУ имени М. В. Ломоносова, Высшая школа государственного аудита, старший преподаватель кафедры государственного аудита, кандидат юридических наук).

ИСТОРИЯ

ЛИТЕРАТУРА

  • Екатерина Евгеньевна ДМИТРИЕВА (Институт мировой литературы, РАН, ст. научный сотрудник; РГГУ, доцент кафедры сравнительной истории литератур).
  • Маргарита Вадимовна ЧЕРКАШИНА (РГГУ, кандидат филологических наук)

СОЦИОЛОГИЯ

  • Степан Борисович ВАСИЛЕНКО (Финансовый университет при Правительстве Российской Федерации, старший преподаватель Департамента политологии и массовых коммуникаций, кандидат политических наук).

ФИЛОСОФИЯ

  • Иван Олегович НЕГРЕЕВ (Православный институт святого Иоанна Богослова, старший преподаватель кафедры религиоведения).
  • Юлия Игоревна ЧУГАЙНОВА (МГУ имени М. В. Ломоносова, философский факультет, старший преподаватель кафедры философии языка и коммуникации).

 

Преподаватели французского языка

Франкоязычное отделение, 1-й курс

1. Оксана Дмитриевна АДОНИНА (МГУ имени М. В. Ломоносова, Высшая школа перевода, старший преподаватель кафедры теории и методологии перевода, кандидат филологических наук).

2. Надежда Валентиновна БУНТМАН (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, доцент кафедры французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения, кандидат филологических наук).

3. Марина Викторовна ГЛАДКИХ (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, преподаватель кафедры французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения).

4. Ольга Дмитриевна ДЕНИСОВА (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, преподаватель кафедры французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения, кандидат педагогических наук).

5. Наталия Викторовна ЕГОРОВА (ФГБОУ ВО «МГЛУ», директор Международного центра франкофонных исследований).

6. Галина Евгеньевна ШУМИЛОВА (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, старший преподаватель кафедры французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения).

Франкоязычное отделение, 2-й курс

1. Галина Ильинична БУБНОВА, по дисциплине «Социология» (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, профессор, заведующая кафедрой французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения).

2. Надежда Валентиновна БУНТМАН, по дисциплине «История» (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, доцент кафедры французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения, кандидат филологических наук).

3. Марина Викторовна ГЛАДКИХ, по дисциплине «Философия» (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, преподаватель кафедры французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения).

4. Людмила Анатольевна ОБУХОВСКАЯ, по дисциплине «Право» (Всероссийская академия внешней торговли, доцент кафедры романо-германских языков, преподаватель-переводчик французского языка).

5. Галина Евгеньевна ШУМИЛОВА, по дисциплине «Литература» (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, старший преподаватель кафедры французского языка для факультета иностранных языков и регионоведения).

Русскоязычное отделение, 1-й курс

1. Наргиз Мирзаагаевна АСКЕРОВА (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет психологии, мл. научный сотрудник кафедры психологии языка и преподавания иностранных языков)

2. Надежда Евгеньевна ГОРДИЕНКО (МГУ имени М. В. Ломоносова, факультет иностранных языков и регионоведения, кандидат педагогических наук, доцент, специалист по учебно-методической работе отдела международного сотрудничества).

3. Светлана Игоревна ПАНЮТА (МГУ имени М. В. Ломоносова, филологический факультет, специалист по учебно-методической работе кафедры русского языка, кандидат филологических наук).

4. Татьяна Борисовна ПОШЕРСТНИК (МГУ имени М. В. Ломоносова, исторический факультет, старший преподаватель кафедры иностранных языков).

Русскоязычное отделение, 2-й курс

1. Наталья Викторовна ЕГОРОВА (ФГБОУ ВО «МГЛУ», директор Международного центра франкофонных исследований)

 

Библиотекарь

 

Переводчик

Елена Игоревна БАЛАХОВСКАЯ

Техническое обеспечение

Анатолий Кириллович ЯНЕВ

5 злых преподавателей — Учёба.ру

 

Ирина Мельник

Кто такая Преподаватель французского языка на факультете экономики и права МГЛУ.
Чем опасна Заставляет зубрить французский до посинения, отправляет на пересдачи.
Причина строгости Верит в то, что студент должен бояться преподавателя.
Противоядие Избавиться от страха провала и выполнять все задания. Мельник стремится вывести всех отстающих на средний уровень, рано или поздно у вас получится.

«Вот ты поступаешь в МГЛУ с английским языком в качестве первого иностранного. И тут слышишь вздохи и удрученный шепот одногруппников: „Нам Ирину Кузьминичну на французский поставили!“ Что это значит? Известно что — приплыли, все, крышка», — рассказал один из студентов МГЛУ.

Чтобы получить у Ирины Мельник положительную оценку на уроке, нужно выучить как минимум десять печатных листов современной французской публицистики наизусть, проделать с десяток упражнений, без ошибок законспектировать предвыборную речь Франсуа Олланда и за три минуты выявить фонетические отличия бельгийского и эльзаского акцентов. Схитрить и сделать одну часть задания не получится — Ирина Кузьминична успевает проверить все части домашней работы у каждого члена группы.

«Каждый день готовлюсь к следующему занятию как к последнему: сквозь панику, слезы. — говорит студент, обучающийся в группе Мельник. — Я хожу кругами по комнате, листая шестую за три месяца учебы тетрадь, полную новых слов, учу и еще раз учу. Иногда мне кажется, что это абсурдное наваждение: до трех ночи в YouTube я снова и снова прокручиваю интервью с Жераром Депардье, который бормочет что-то непонятное. Прихожу на семинар, сажусь рядом с трепещущими друзьями и встречаю пронзительный взгляд Ирины Кузьминичны. Иногда, я не шучу, хочется перекреститься».

 

Ирина Улицкая

Кто такая преподаватель организации, нормирования и оплаты труда на транспорте, профессор кафедры экономики автомобильного транспорта экономического факультета МАДИ.
Чем опасна валит на экзамене за плохую работу в течение семестра.
Причина строгости особое положение на факультете.
Противоядие постоянно быть в контакте с преподавателем, выполнять всё, что она говорит. И не подходите к ней, если она в черном!

Говорят, что на первой лекции Ирина Улицкая предупреждает студентов: «Да, признаюсь, вам не повезло. Первая серьезная исследовательская работа и такой жесткий преподаватель, как я. Мужайтесь». Первый курсовой проект третьекурсники экономического факультета сдают именно Ирине Михайловне, и это является для многих проверкой на прочность. Профессор Улицкая разбивает свои лекции по блокам, в конце каждого из которых просит принести те части проекта, в которых используются расчеты пройденной части курса. Обычно это 5-6 листов в неделю. Пропускать лекции категорически нельзя — именно на них она объясняет правильную методику выполнения работ. Также необходимо сдавать все части проекта в срок.

«Ирина Михайловна — необычайно скрупулезный преподаватель, — продолжает Александр Котов, — Я сам видел, как она проверяет каждый расчет, пересчитывает, с линейкой проверяет отступ от левого края листа. Если она обнаруживает малейшую неточность, перечеркивает всю часть работы и просит переделать. Не сдал вовремя — тебя просто будут игнорировать и предупредят о больших проблемах на экзамене».

Если студент болел, пропускал консультации или сдал проект только к началу сессии, недопуск к зачету, автоматическая пересдача, грозящая отчислением, гарантирована. Улицкая — не последний человек на факультете, и не любит иметь дело с отстающими. К тому же, по замечаниям учащихся, Ирина Михайловна — человек настроения. Если вы заметили ее, одетую во все черное, лучше не подходите, иначе будет худо. И наоборот, разговор завяжется, если она в яркой одежде.

 

Александр Волков

Кто такой заведующий кафедрой общего и сравнительно-исторического языкознания филологического факультета МГУ, преподает введение в языкознание
Чем опасен задает на экзаменах вопросы за пределами программы
Причина строгости считает свой предмет обязательным для всех
Противоядие научиться мыслить как лингвист — Волков ценит не только знания, но научную смекалку, умение быстро разобраться в незнакомом материале.

Представьте себе, что вам предстоит сдавать экзамен Льву Толстому — старцу с прозорливым взором и непоколебимыми принципами. И вопрос по «Войне и миру», причем с максимальной детализацией эпизодов и точным воспроизведением французских фрагментов — в каждом билете. Примерно с таким настроением студенты первого курса филфака МГУ приходят сдаваться Александру Александровичу Волкову. На первой же лекции Александр Александрович заявляет аудитории: «Кто меня спросит, зачем нужно языкознание, я его сразу выгоню. Наука вообще никому не нужна, кроме тех, кто ею занимается».

Надо сказать, языкознание — вообще предмет «вырвиглаз», а сдавать экзамены авторам учебников и десятков монографий всегда непросто. Но в случае с профессором Волковым знание текста учебника, им же написанного, и даже прочитанные монографии его авторства не гарантируют положительной оценки. На экзамене он любит спросить, каково происхождение того или иного языка. Этот вопрос, как правило, затруднений не вызывает. Но затем он разворачивает на столе карту и просит по ней рассказывать о распространении и развитии языка, в каком ареале зародилась его письменность и так далее.

«Сдавать языкознание Волкову восемь раз — обычное дело, — рассказала выпускница филфака Элина Челинцева. — Я свою тройку получила после шестого, при том, что готовиться начала за месяц. После того, как я ему пересказала весь учебник, Александр Александрович мне сказал: «Конечно, филологом вы не станете, но базу уловили, так что в сельской школе преподавать сможете».

 

Евгения Альбац

Кто такой профессор факультета прикладной политологии Высшей школы экономики
Чем опасна непоследовательна в решениях, может быть высокомерной по отношению к студентам
Причина строгости Неизвестна. Столь же эмоционально общается с коллегами-журналистами и радиослушателями.
Противоядие рецепта нет.

История рассудит, насколько удачен был эксперимент по внедрению в Высшую школу экономики журналиста со степенью PhD по политологии, полученной не где-нибудь, а в Гарварде. В журналистских кругах Евгения Марковна Альбац пользуется неоднозначной репутацией — одни коллеги ревнуют ее к успеху, другие обвиняют в непрофессионализме. Гостям эфира в ее авторских программах на радио «Эхо Москвы» приходится отвечать на провокационные, иногда бестактные вопросы и оправдываться за то, что было и чего не было. Оппозиционно настроенная Евгения Марковна бесстрашно жжет глаголом и припечатывает междометиями современные нам ужасы российской действительности.

Будучи дамой эмоциональной, иногда до экзальтации, свои лекции перед студентами факультета прикладной политологии она так же обставляет элементами театрализации. По отзывам людей, которым довелось слушать и, главное, сдавать политологию Евгении Марковне, никогда невозможно угадать наперед, какие ответы будут встречены благосклонно, а какие вызовут ее праведный гнев с последующей отправкой на пересдачу.

Студенты «Вышки» жалуются на субъективизм, нелогичную программу, не учитывающую всего спектра актуальных политологических теорий, и непредсказуемую реакцию профессора, которая может быть разной в зависимости от времени года, розы ветров и результатов выборов в Венесуэле. К Альбац можно найти подход и даже стать ее любимым студентом — прецеденты есть. Но «формула любви» лежит в яйце, яйцо — в утке, утка — в зайце… В общем, каждый ищет и находит этот хрустальный ларец с секретом сам. Или не находит.

 

Анатолий Вестяк

Кто такой профессор МАИ, преподает ряд математических дисциплин
Чем опасен Бульдожьей хваткой. Не отпустит, пока студент не сдаст. Никогда.
Причина строгости Считает себя ответственным за базовую математическую подготовку студентов, хочет научить каждого.
Противоядие Творческое освоение математической литературы. Сам Вестяк утверждает, что у него пятерки получают те, кто умеет самостоятельно доказывать теоремы.

Профессор Анатолий Васильевич Вестяк уже давно вошел в студенческий фольклор, стал героем анекдотов, песен и сатирических куплетов. Вестяк — это стихийное бедствие и редкое природное явление в одном лице. Лучше один раз попасть к нему на экзамен, чем сто раз услышать, как это делали другие. Его имя как-то даже промелькнуло в телерепортаже из Чечни: в кадр въехал танк, на броне которого красовалась неприличная надпись про Вестяка. Возможно, один из отчисленных студентов хотел таким образом выразить свое отношение к преподавателю-извергу. Как-то студенты якобы подкараулили его в темном переулке, но Вестяк, будучи мастером спорта по боксу, дал достойный отбор. На другой день один из нападавших пришел на экзамен с подбитым глазом. Анатолий Васильевич оценил смелость и отпустил с «тройкой».

Зачем Вестяк терзает студентов? С какой целью на экзамене гоняет по всему курсу, позволяя себе на сдаче линейной алгебры задавать вопросы по курсу матана? Явно не из садистских наклонностей, как это может показаться. У него железобетонные принципы, о которых он оповещает всех, кто приходит к нему на первую лекцию: «Студент должен уметь мыслить. Матан надо знать».

Материал подготовлен на основе публикации в журнале «Куда пойти учиться» №11 за 2012 год.

Поступили хорошо – Огонек № 32 (5141) от 16.08.2010

Экзамены в вуз — испытания не только для будущих студентов, но и для их родителей и, как ни странно это звучит, самих экзаменаторов

Как стать студенткой

Я поступала в пять разных вузов, ведь по новым правилам в большее количество учебных заведений подавать документы нельзя, а я очень боялась не увидеть свою фамилию в списке студентов. Документы отнесла на иняз в МГУ, Лингвистический университет (он же МГЛУ), РГГУ, Социальный университет (РГСУ) и Институт США и Канады РАН — там есть факультет мировой политики Государственного университета гуманитарных наук.

В РГГУ я подавала документы на историко-архивный и на международные отношения. Специально выбрала факультеты, где нет дополнительных испытаний. Когда я туда с документами пришла, мне говорят: «Да вам с такими баллами надо в МГУ подавать». Конечно, я мечтала попасть в МГУ, но, если честно, не очень надеялась. Мне сказали, что там все уже заранее занято олимпиадниками. А Социальный университет я рассматривала как запасной вариант. Там были огромные очереди, кстати, как и в РГГУ, неразбериха и странные претензии — фотографии должны быть только черно-белые, а заявление писать можно только синей ручкой.

В МГУ и документы было проще сдавать, и экзамен. Нам дали один вариант на весь ряд, и сидели мы через человека: можно было и списать, и спросить у соседа. Преподаватели относились к этому с пониманием и даже улыбались. А вот в Лингвистическом университете с организацией было не очень хорошо. Вступительный я сдавала не в кабинете или аудитории — в столовой, меня даже не было видно проверяющим! Так много сдающих было. А сами вопросы там были намного сложнее, чем в МГУ. Процедура объявления результатов в МГЛУ мне не понравилась. Они вывесили у себя на сайте огромный список тех, кто «может рассматриваться» на поступление. На регионоведении, куда я поступала, было всего 30 мест. А в списке человек 200, и помечено — «на бюджет». Смотрю — моя фамилия! Думаю, наверное, кто быстрее донесет документы, того и примут. Я бегом туда с документами. Подала, а потом спрашиваю: «Я уже студентка?» Оказалось, что нет. Вуз еще будет выбирать из тех, кто подал документы. А у меня баллы-то не очень высокие. Я запаниковала и документы забрала.

И не жалею. Я ведь поступила в МГУ, хоть и не на бюджетное отделение, а на платное. И в Институт США и Канады РАН тоже поступила — на бюджет. А про остальные вузы просто не знаю — уж очень хотелось поехать отдохнуть после этого сумасшедшего года.

Татьяна Пивень, студентка МГУ. Записала Анастасия Шпилько

Записки отца

Мой сын окончил в этом году школу и поступил в Высшую школу экономики. Другой бы сказал: «Мы прошли через ужас ЕГЭ и чистилище приемной комиссии». Я — воздержусь.

Наверное, нам просто повезло. Но за 10 лет в обычной московской школе N 719, где учился сын, с нас не требовали никаких взносов, не ставили условий. А поскольку директором школы там работает офицер запаса, то и за безопасность своих детей мы не волновались. Что касается учителей, то они «нагрузили» ребят знаниями неплохо. Может, поэтому парень без эксцессов поступил в университет?

Готовиться к поступлению сын начал за два года до окончания школы. Он пошел на подготовительные курсы при Вэшке и 4-5 раз в неделю после школы ехал на занятия на противоположный конец Москвы. Знаю, что многие считают, дескать, подготовительные курсы при вузах — это цивилизованная форма взятки, за два года занятий вы платите примерно столько же, сколько пришлось бы положить в карман какого-нибудь члена приемной комиссии. Но мы видели результат! Парень пришел туда, высокомерно поглядывая по сторонам, ведь в своей школе он был одним из лучших. После первых же тестов его спесь улетучилась, он оказался во второй сотне. Сын опешил. А потом разозлился и решил доказать, что способен на большее. Каждые два месяца приходилось сдавать тесты. И каждый раз мы видели, что он на несколько строчек поднимается вверх. Это сильный стимул.

В начале 11-го класса нужно было выбрать один из двух вариантов поступления в институт: ориентация на сдачу ЕГЭ или участие в профильной всероссийской олимпиаде. Мы выбрали олимпиадный путь. Этот вариант сейчас нравится и вузам. Лишившись возможности проводить собственные вступительные экзамены, институты охотно идут на проведение профильных олимпиад, потому что это дает им возможность отобрать действительно знающих абитуриентов.

Сроки олимпиады подогнаны таким образом, что расслабиться нельзя до самого конца, и для страховки школьник должен заниматься по всем предметам, результаты ЕГЭ по которым нужны при поступлении. За три месяца сын прошел через 4-5 олимпиад: московскую городскую, всероссийскую, олимпиады в вузах и т.д. Это был дикий стресс, но он себя оправдал. За неделю до экзаменов в школе Вэшка объявила список победителей олимпиады, которые будут зачислены на бюджетное отделение. У нас все получилось.

Павел Шеремет

Прием окончен!

На мой взгляд, приемная кампания очень затянута. Сегодня она начинается 20 июня: еще никто не получил документы, еще не прошли выпускные, а вузы уже должны собирать приемные комиссии, отрывать сотрудников от основной работы.

Опять-таки, зачем после оглашения результатов экзаменов давать почти 10 дней на выбор вуза, разрешать подавать документы во множество мест? Многие ребята в итоге подают документы в несколько вузов, чтобы просто попробовать, потешить самолюбие, подстраховаться.

У нас в МФТИ есть процедура собеседования, и я знаю, кто из ребят действительно собирается поступать, а кто просто пришел попробовать. Но по правилам министерства мы вынуждены рекомендовать к зачислению людей с высокими баллами, не учитывая их реальные цели. В итоге те, кто «пробуется», фактически занимают место человека, который набрал меньше, но целенаправленно шел именно в наш вуз. Ребята, которые не попадают в число рекомендованных, не хотят остаться без мест и, в свою очередь, начинают метаться между вузами, подают документы всюду, где только возможно.

Ребята к нам идут умные. Вообще, доля людей, наделенных способностями в области естественных наук, в России стабильна, около 12 процентов. Но есть проблема: государство, в том числе школьные и региональные администрации, нацелено на показатель ЕГЭ. В итоге у детей тренируют в первую очередь память, а не аналитические способности. Из-за этого в прошлом году мы были вынуждены проводить с ребятами занятия по школьной программе. В итоге ребята подтянулись. В этом году мы обязательно это повторим.

Юрий Самарский, проректор МФТИ по учебной работе. Записал Всеволод Бельченко

Чистова Елена Викторовна | Институт филологии и языковой коммуникации

Занимаемая должность

Заведующая кафедрой восточных языков

Руководитель Центра китайского языка и культуры при Институте филологии и языковой коммуникации

Руководитель региональной контент-группы по разработке профессионального стандарта «Специалист в области перевода»

Член Евразийской ассоциации китаеведов

Член Союза переводчиков России

Член Ассоциации преподавателей перевода
Член Российской ассоциации лингвистов-когнитологов
Докторант Сибирского федерального университета

 

Контакты

660041 Красноярск, пр. Свободный 82А, ауд. 3-36

тел. +7 (391) 206-26-81

Ученая степень

Кандидат филологических наук

Ученое звание

Доцент

Образование

1999–2004 Красноярский государственный университет, специальность «Лингвистика и межкультурная коммуникация» (китайский, английский языки)

2014 г. – кандидатская диссертация «Терминосистемы в условиях глобанглизации: симметрико-ориентированный подход (на материале брендинг-литературы)» (Санкт-Петербургский государственный экономический университет)

Общий стаж: 15 лет 

Стаж по специальности: 15 лет

Стажировки

Пекинский государственный технический университет, г. Пекин, КНР (2003)

Хейлунцзянский государственный университет, г. Хейхе, КНР (2002)

Научная работа со студентами

  •  Подготовка студентов к участию в:
  1. Международной научно-практической конференции молодых исследователей «Язык, дискурс, (интер)культура в коммуникативном пространстве человека» в секции «Актуальные проблемы современного востоковедения»: Борисова Елизавета – диплом I степени; Моргун Виктория – диплом I степени; Дмитриева Снежана – диплом II степени;
  2. Международной научной студенческой конференции «МНСК-2016» в секции «Иностранные языки: лингвистика и межкультурная коммуникация» (НГУ, г. Новосибирск): Фокина Мария – диплом III степени;
  3. Межрегиональной олимпиаде по переводу среди студентов-востоковедов (Секция «Китаеведение») (МГЛУ ЕАЛИ, г. Иркутск, 11 марта 2015 г.): Васильева Александра – диплом III степени.

Ключевые публикации

Гранты

В 2010 году приняла участие в конкурсе Российского фонда фундаментальных исследований по программе «Мобильность молодых ученых», по результатам которого получила грант на участие в научном мероприятии, проводимом на территории России (10-07-16039-моб_3_рос; исполнитель).

С 2014 года участвует в стратегических проектах СФУ в области  электронного обучения и дистанционных образовательных технологий: «Развитие ЭО и ДОТ», «Менторы ЭО», «Менторы ЭО 2.0», «Фиксация учебных достижений обучающихся».

Повышение квалификации

Список

Электронные образовательные ресурсы

1. Электронный обучающий курс «Основы переводоведения». URL-адрес в системе электронного обучения СФУ: https://e.sfu-kras.ru/course/view.php?id=15035.

2. Электронный обучающий курс «Практикум по переводу первого иностранного языка (китайский язык)». URL-адрес в системе электронного обучения СФУ: https://e.sfu-kras.ru/course/view.php?id=8776.

3. Электронный обучающий курс «Перевод в сфере деловой коммуникации (китайский язык)». URL-адрес в системе электронного обучения СФУ: https://e.sfu-kras.ru/course/view.php?id=7672

Филиал удалён в Новосибирске — отзыв и оценка — Ягода Малина

Про обман.

Наверное все помнят, как сентябрь нас «порадовал» ветром с дождями? Мы оказались тоже не готовы к такой погоде и стали искать комбез по приемлемой цене. Заехали в один магазин- размеров нет, и в одной из групп в вк, я увидела рекламу этого магазина,где говорилось, что сейчас комбез со скидкой, цена 2200, плюс рядом с домом. Был пасмурный…

Показать целиком

Про обман.

Наверное все помнят, как сентябрь нас «порадовал» ветром с дождями? Мы оказались тоже не готовы к такой погоде и стали искать комбез по приемлемой цене. Заехали в один магазин- размеров нет, и в одной из групп в вк, я увидела рекламу этого магазина,где говорилось, что сейчас комбез со скидкой, цена 2200, плюс рядом с домом. Был пасмурный день, когда мы зашли нам сначала сказали размеров нет, но потом продавец вспомнила, что остался один подходящий комбез, висел на вешалке, рядом с входом справа. Мы очень обрадовались, яркий, красивый, тёплый. Но оказалось, что терминал ещё у них не подключен, а налички с собой нет, карта мужа и перевод сделать я не смогу. Попросила отложить и пошла с ребёнком (4года) до банкомата. Попали под жуткий ливень, да такой, что нас хоть выжимай, но мы вернулись и оплатили товар. Всё было хорошо, пока сегодня я не решила его постирать. Захотела посмотреть этикетку о правилах стирки и о, чудо! А комбез-то некой Лены Ш. оказывается! Подписан не смываемым маркером т.к надпись не отстирывается. Я очень расстроилась, сразу написала представителю в группу вк. Меня уверяли, что у них нет б/у, вещи новые, что может вообще это написал ребёнок мой,(я не зря выше указала возраст, писать не умеет), понятно, что комбез принесён на обмен, но заверили, что он не ношенный, но ведь вещи не будут подписывать если не уверенны в размере. У меня спросили чек, которого конечно у меня уже давным давно нет, да и писала я это не для возврата денег или обмена, а для объяснений и извинений. Представитель так и не извинилась, даже после того как я сделала на этом акцент. Неприятно и обидно. Будьте внимательны при покупке.

Дополняю отзыв. Зашла удалиться из их группы , а меня уже удалили и представитель в чёрный список кинула😁😁👍🏻

P.S. Сегодня был итог ситуации. На протяжении вчерашнего дня, представитель то добавляла то удаляла из чёрного списка. Поздно вечером, она вновь написала, но уже о том, что я подключила каких-то подруг, что пишу ей в личные сообщения с другой страницы, что надписи не было и в виде «исключения» вернёт деньги. Сделав такое одолжение, она так и не извинилась. Сегодня мне написала мама этой девочки, которая объяснила, что комбез куплен летом, его не носили был велик, в холода, перед садом подписали, а одели — он большой, его вернули, а про надпись забыли, предложила купить обратно. Представителю магазина нужно нужно учиться у этой девушки вести диалог, извинений так и не было, она настаивает, что это я. Благодаря этой чудесной девушке, я теперь знаю, что он новый, а так же то, что вещи не осматривают после возврата, как в этом настаивала представитель. Всем спасибо!

Метаботропные глутаматные рецепторы группы II и III участвуют в различных аспектах обработки зрительных реакций в верхнем двухолмии крысы и Нельсон, 1987). В поверхностных слоях SC (SSC) нейроны реагируют исключительно на визуальные события, в то время как большинство нейронов в промежуточных и глубоких слоях являются «мультимодальными» и дополнительно реагируют на слуховые и соматосенсорные стимулы (Sparks & Nelson, 1987).Критически важно, чтобы нейроны в SC могли различать новые и постоянные стимулы. С этой целью нейроны в SSC «привыкают», вызывая сильную реакцию на первоначальный зрительный стимул, а последующие предъявления стимула через короткие интервалы времени вызывают снижение реакции (Oyster & Takahashi, 1975; Stein, 1984; Sparks & Нельсон, 1987). Передатчиком, опосредующим визуальный вход в SSC, вероятно, является l-глутамат, действующий на ионотропные рецепторы, вызывая возбуждающий ответ (Roberts

et al. 1991; Биннс и Солт, 1994). Однако рецепторы метаботропного глутамата (mGlu) также присутствуют в SSC и могут модулировать зрительные реакции (Cirone & Salt, 2000). Известно восемь рецепторов mGlu (mGlu1-mGlu8), и их можно разделить на три группы на основе гомологии последовательностей, фармакологии и связи с путями вторичных мессенджеров (Nakanishi, 1992; Conn & Pin, 1997). Исследования в различных областях мозга показали, что рецепторы группы I (mGlu1 и mGlu5), которые преимущественно связаны с постсинаптическим метаболизмом инозитолфосфата, участвуют в физиологических процессах, таких как обучение и память, двигательный контроль и ноцицепция (Conn & Pin, 1997).Напротив, рецепторы группы II (mGlu2 и mGlu3) и группы III (mGlu4 и mGlu6-mGlu8) преимущественно связаны с тормозным каскадом циклического АМФ и, как предполагается, являются пресинаптическими рецепторами во многих областях мозга (Conn & Pin, 1997). . Однако физиологическая роль рецепторов групп II и III менее ясна, чем роль рецепторов группы I, хотя на основании 90 003 исследований in vitro 90 004 было высказано предположение, что они могут активироваться глутаматным «распространением» в периоды интенсивной синаптической активности. активности, чтобы уменьшить синаптическую передачу (Scanziani et al. 1997; Русаков и Кульманн, 1998; Митчелл и Сильвер, 2000). Кроме того, неясно, можно ли приписать этим разным группам рецепторов разные функциональные роли. В текущем исследовании мы изучили физиологические и функциональные роли рецепторов mGlu групп II и III в различных аспектах обработки зрительных ответов. Во-первых, мы исследовали возможность того, что активация рецепторов mGlu эндогенным глутаматом усиливается во время высококонтрастных визуальных стимулов, чтобы подавлять зрительные реакции.Во-вторых, мы исследовали возможную роль рецепторов группы II и III в формировании реакции привыкания.

МЕТОДЫ

Хирургия, регистрация и ионофорез

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 г. и соответствующими инструкциями. Внеклеточные записи потенциалов действия были сделаны из одиночных нейронов SSC с использованием многоствольных стеклянных ионофоретических микропипеток у взрослых крыс Lister Hooded, наркотизированных уретаном (1.25 г кг -1 и.п.) (Binns & Salt, 1997). Пипетки вставляли в подкожную клетчатку через трепанацию черепа, как подробно описали Binns & Salt (1997). Цилиндры пипеток содержали набор следующих растворов: 1-2-амино-4-фосфономасляная кислота (1-АР4, рН 7,5), {«тип»:»энтрез-нуклеотид»,»аттр»:{«текст»: «LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}}LY354740 (pH 8,5), {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″ ,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 (pH 8.5), ( R,S) -α-метил-4-фосфонофенилглицин (MPPG, pH 8,5), ( R,S) -α-циклопропил-4-фосфонофенилглицин (CPPG, pH 8,5) (все 25 мм в H 2 O), {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″,»term_id»:»875599329″,»term_text»:»CGP35348″} }CGP35348 (10 мМ в H 2 O, pH 3), 100 мМ NaCl, 1 м NaCl для балансировки тока, 4 м NaCl для внеклеточной записи и Pontamine Sky Blue для маркировки участков записи. Все препараты находились в бочках с малыми положительными удерживающими токами (8-15 нА) и эжектировались в виде анионов, за исключением {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″ ,»term_id»:»875599329″,»term_text»:»CGP35348″}}CGP35348, который удерживался с отрицательным током и выбрасывался в виде катиона.Потенциалы действия стробировались с помощью дискриминатора формы волны, измерялись по времени и записывались с использованием компьютерного интерфейса CED 1401 и программного обеспечения VS (Cambridge Electronic Design, Великобритания), которое генерировало временные гистограммы перистимула (PSTH). В конце эксперимента крысу умертвили передозировкой уретана.

Зрительные стимулы

Электронно-лучевая трубка (ЭЛТ; Tektronix) использовалась для отображения визуальных стимулов, созданных генератором визуальных стимулов Picasso под управлением компьютера. ЭЛТ располагалась в рецептивном поле нейрона на расстоянии 15 см от левого глаза испытуемого.Циклы стимула, не вызывающего привыкания, состояли из 10 предъявлений светлых полос (яркость либо 20, либо 12,2 кд·м –2) на темном фоне (3,1 кд·м –2), 5 × 10–15°, движущихся под углом 22,5° с. −1 в течение 4 с каждые 10 с. В качестве стимула привыкания — чтобы надежно вызвать привыкание к ответу — использовался стимул, движущийся в течение 2 с с интервалом 0,5 с между каждым из пяти предъявлений. Эта последовательность была представлена ​​для пяти проб с интервалом между пробами 10 с. Этот протокол подобен тому, который ранее показал свою эффективность в выявлении привыкания Binns & Salt (1997).Движущиеся полосы имели предпочтительную ориентацию и направление.

Экспериментальный протокол

Контрольные циклы зрительных стимулов для вызывания воспроизводимых ответов были установлены перед предъявлением двух или трех циклов во время непрерывного выброса исследуемого вещества. Затем были получены данные о восстановлении перед сбором новых контрольных данных и дальнейшим применением лекарств. Чтобы определить, может ли антагонист группы II {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 блокировать действие агониста группы II {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}} LY354740 или агонист группы III l-AP4, антагонист непрерывно выбрасывался в течение трех циклов, прежде чем агонист выбрасывался совместно с антагонистом в течение трех циклов.Затем выброс агониста/антагониста прекращали и затем получали данные о восстановлении. Аналогичным образом, чтобы исследовать эффект антагониста GABA B {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″,»term_id»:»875599329″,»term_text»:» CGP35348″}}CGP35348 при модулировании привыкания агонистами или антагонистами группы III, {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″,»term_id»:»875599329″,»term_text «:»CGP35348»}}CGP35348 непрерывно выбрасывался в течение двух или трех циклов, прежде чем соединения Группы III были выброшены совместно с {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″,» term_id»:»875599329″,»term_text»:»CGP35348″}}CGP35348 за два цикла.Затем выброс агониста/антагониста группы III прекратился, пока {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″,»term_id»:»875599329″,»term_text»:»CGP35348″}} CGP35348 был выброшен еще на два цикла. Затем были получены данные восстановления.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Активация рецепторов mGlu группы II и группы III во время зрительных ответов

Записи проводились с 52 нейронов у 32 крыс. Чтобы исследовать функцию рецепторов mGlu группы II, мы использовали групповой селективный агонист {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″ ,»term_text»:»LY354740″}}LY354740 и антагонист {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:» LY341495″}}LY341495 в качестве инструментов (Kingston и др. 1998; Монн и др. 1999). Применение агониста группы II (ток ионофореза от -25 до -75 нА) вызывало либо обратимое торможение, либо усиление зрительных ответов нейронов ССК. В 53 % из 43 клеток агонист вызывал облегчение зрительных реакций (до 140 ± 4,7 % от контроля), тогда как у остальных он вызывал угнетение зрительных реакций (до 74 ± 8,6 % от контроля) (). Антагонист группы II (от -25 до -50 нА) был способен противодействовать эффектам агониста при совместном применении двух соединений ().Кроме того, при применении отдельно антагонист (от -25 до -75 нА) оказывал эффект, противоположный агонисту, как в клетках, где агонист вызывал ингибирование или усиление зрительных реакций (ответы усиливались до 124 ± 3,5 % от контроля, так и снижались до 74 ± 4,1 % от контроля соответственно; Это указывает на то, что рецепторы группы II активируются эндогенным лигандом во время зрительной стимуляции. Эти результаты качественно аналогичны тем, о которых мы сообщали ранее (Cirone & Salt, 2000) с использованием селективного агониста группы III l-AP4 и антагонистов группы III CPPG и MPPG (Bedingfield et al. 1996; Томс и др. 1996), что указывает на активацию рецепторов mGlu как группы II, так и группы III во время этих зрительных ответов. Кроме того, действия l-AP4 и {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}} LY354740 изучали на одном и том же нейроне в 22 случаях. Распределение эффектов агонистов группы II и группы III по количеству клеток, демонстрирующих эффект агониста, в процентах от контроля показано на рис.Очевидно, что нейроны, которые были ингибированы любым агонистом, образуют отдельную популяцию от нейронов, у которых визуальные ответы были облегчены, а не единую популяцию, распределенную примерно на 100% от контрольной. Однако анализ глубины записи в пределах SSC и рострокаудальной или медиолатеральной локализации не выявил какой-либо корреляции с эффектом агониста.

Модуляция зрительных ответов рецепторами группы II

A , перистимульно-временная гистограмма (PSTH) записывает отдельный нейрон, показывающий, что агонист группы II {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{» text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}}LY354740 (a ) и антагонист {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст «:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 (b ) имеют противоположный эффект в одном и том же нейроне.В этом нейроне {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}}LY354740 оказывает облегчающее действие. , в то время как {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 вызывает торможение зрительных реакций . B , данные другого нейрона (сравните с A ), где {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,» term_text»:»LY354740″}}LY354740 (a ) подавляет зрительные реакции и {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″ ,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 (b ) вызывает упрощение.Гистограммы показывают совокупное количество пиков потенциала действия (i) в контрольных условиях, (ii) во время {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336 «,»term_text»:»LY354740″}}LY354740 или {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:» Выброс LY341495″}}LY341495, (iii) данные восстановления, полученные через 120 с после прекращения выброса лекарственного средства. Детали стимула: предъявление десяти зрительных стимулов (5 × 15 град.), движущихся со скоростью 22,5 град. с -1 в течение 4 с каждые 10 с; размер бина, 200 мс; продолжительность испытания, 110 с.Движущиеся полосы имели предпочтительную ориентацию и направление. Зрительные стимулы предъявлялись в течение периода, отмеченного закрашенной полосой под каждой гистограммой. На этом и последующих рисунках метки (например, JmGluR60/A) обозначают эксперименты, из которых были созданы иллюстрации.

Как антагонист группы II {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 может также обладают некоторой антагонистической активностью в отношении рецепторов группы III (Kingston et al. 1998), мы проверили его действие на l-AP4. l-AP4 (-50 нА) все еще был способен оказывать эффект во время непрерывного выброса {«type»:»entrez-нуклеотида»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759 «,»term_text»:»LY341495″}}LY341495 (, ), указывая, что {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″, «term_text»:»LY341495″}}LY341495 имеет селективность группы II в этом исследовании. Это указывает на то, что рецепторы группы II и группы III действуют в этой области мозга по-разному.

Избирательные эффекты антагониста группы II {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}} LY341495

Данные одного нейрона, показывающие, что {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″} }LY341495 блокирует влияние на зрительные реакции {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}} LY354740, но не влияет на l-AP4, и, следовательно, оказывает специфическое действие на mGluR группы II.Подробнее о стимулах и гистограммах см. рис. 1. a и b , редукция зрительных ответов на {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id «:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}}LY354740. c , восстановление после воздействия {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}} LY354740. d f , обратимое усиление зрительных реакций и антагонизм {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text «:»LY354740»}}LY354740 по {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}} LY341495. г , восстановление после воздействия {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}} LY341495. h-j , обратимое снижение зрительных реакций с помощью l-AP4. км , усиление зрительных ответов по {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}} LY341495, но отсутствие антагонизма эффекта l-AP4. n , восстановление после воздействия {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}} LY341495.

Эффект антагонистов группы II варьируется в зависимости от величины зрительного ответа

Как и предыдущая работа in vitro в других областях мозга показала, что активация рецепторов mGlu происходит в условиях интенсивной синаптической активации (Scanziani et al. 1997; Русаков & Kullmann, 1998; Mitchell & Silver, 2000), мы исследовали, зависит ли активация рецепторов mGlu группы II или III от степени синаптического входа, путем изменения контраста между передним и задним планом зрительного стимула.Уменьшение контраста привело к зрительной реакции, которая в среднем составила 41 ± 4,4 % от реакции при нормальном полном контрасте. В условиях низкой контрастности эффекты антагониста группы II были менее заметными, чем в условиях высокой контрастности, независимо от того, ингибировал или ослаблял антагонист зрительные реакции (, ). Однако при применении антагонистов группы III (MPPG или CPPG, от -25 до -75 нА) наблюдалась небольшая разница в эффекте между условиями стимула с высокой и низкой контрастностью (таблица 2).

Таблица 2

Эффект антагонистов при низкой и высокой контрастности

mGluR группы III и привыкание к зрительному ответу

протокол визуальной стимуляции, который приводил к привыканию к реакции (то есть пять одиночных стимулов предъявлялись с интервалом 0,5 с, Binns & Salt, 1997). В таких условиях реакция на последний стимул обычно составляла около 42 ± 3.на 9 % меньше, чем реакция на первый раздражитель. Средняя степень привыкания, наблюдаемая при использовании стимулов с полным контрастом, существенно не отличалась от таковой, наблюдаемой в тех же клетках при использовании стимулов с более низким контрастом. Агонист группы III l-AP4 вызывал увеличение степени привыкания к ответу в клетках, где l-AP4 ингибировал зрительный ответ (1), тогда как применение антагонистов группы III MPPG или CPPG снижало степень привыкания к ответу в тех же клетках (12). .Напротив, агонист группы II ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}}LY354740 ) и антагонист группы II ({«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»LY341495″,»term_id»:»1257705759″,»term_text»:»LY341495″}}LY341495) не оказывают такого влияния на степень привыкания к ответу (). Поскольку рецепторы GABA B (но не GABA A ) также участвуют в формировании реакции привыкания в SSC (Binns & Salt, 1997), мы также исследовали влияние на реакцию привыкания, вызываемое агонистом и антагонистом группы III. в присутствии антагониста GABA B {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″,»term_id»:»875599329″,»term_text»:»CGP35348″} }CGP35348.Антагонист GABA B , эжектируемый отдельно (от +25 до +100 нА), вызывал снижение реакции привыкания на 16,3 ± 3,4%, что соответствует антагонизму GABA B , как описано ранее (Binns & Salt, 1997). В присутствии антагониста GABA B l-AP4 все еще увеличивал степень привыкания (таблица 3), в то время как MPPG уменьшал степень привыкания (1). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что рецепторы группы III специфически принимают участие в механизме привыкания к реакции и что это не зависит от рецепторов ГАМК B .

Активация рецепторов группы III модулирует реакцию привыкания

Записи PSTH от одного нейрона, демонстрирующие влияние l-AP4 на реакцию привыкания в отсутствие и в присутствии {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{ «текст»: «CGP35348», «term_id»: «875599329», «term_text»: «CGP35348»}}CGP35348. На гистограммах показано количество спайков, вызванных пятью предъявлениями идентичных стимулов (движущаяся полоса 5 × 10 градусов, движущаяся со скоростью 44 градуса с –1 в течение 2 с с межстимульным интервалом 0.5 с; размер бина, 200 мс, совокупные данные из пяти испытаний показаны для каждого графика). На каждой панели показана степень привыкания к реакции (рассчитанная, как описано в разделе «Методы»). A-C , l-AP4 усиление реакции привыкания. D-H , {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CGP35348″,»term_id»:»875599329″,»term_text»:»CGP35348″}}CGP35348 уменьшенное привыкание к реакции, но не уменьшал эффект l-AP4.

Таблица 3

Влияние групповых препаратов на реакцию привыкания

ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящее исследование показало, что активация рецепторов mGlu группы II с использованием {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{» text»:»LY354740″,»term_id»:»1257481336″,»term_text»:»LY354740″}}LY354740 может оказывать тормозящее или облегчающее воздействие на зрительные реакции в SSC.Это напоминает наши предыдущие результаты с агонистом группы III l-AP4 (Cirone & Salt, 2000), и это показывает, что оба этих типа рецепторов могут влиять на визуальную обработку в SSC. Кроме того, наши данные о том, что антагонисты рецепторов группы II и группы III влияют на зрительные ответы в противоположном направлении по отношению к соответствующим агонистам на данном нейроне, указывают на то, что эти рецепторы могут активироваться эндогенным лигандом во время зрительной синаптической передачи. В настоящее время хорошо известно, что рецепторы mGlu группы II и группы III участвуют в пресинаптическом ингибировании высвобождения нейротрансмиттера во многих центральных синапсах (Forsythe & Clements, 1990; Calabresi et al. 1992; Хаяши и др. 1993; Солт и Итон, 1995; Конн и Пин, 1997). Эти действия могут включать ингибирование высвобождения самого глутамата или ингибирование высвобождения тормозной аминокислоты ГАМК. Предыдущие работы этой лаборатории показали, что как глутаматергические возбуждающие, так и ГАМКергические тормозные процессы участвуют в зрительных реакциях в SC (Roberts et al. 1991; Binns & Salt, 1994, 1997). Таким образом, вполне вероятно, что ингибирующее действие на зрительные реакции агонистов группы II и группы III обусловлено пресинаптическим ингибированием высвобождения глутамата, тогда как облегчающее действие этих агонистов может быть связано с уменьшением ГАМКергической передачи (либо непосредственно, либо путем снижения возбуждающий вход интернейронов).Вероятно, ионофоретическое применение агонистов mGlu в ССК может оказывать как тормозное, так и возбуждающее действие из-за различий в пространственном расположении разных типов клеток по отношению к точечному источнику экзогенного лекарственного средства. Кроме того, в физиологическом контексте эффект активации рецептора mGlu будет также зависеть от пространственного соотношения рецепторов по отношению к месту высвобождения медиатора.

Хотя на первый взгляд кажется, что активация рецепторов группы II оказывает такое же влияние на зрительные ответы нейронов SSC, как и активация рецепторов группы III, из наших данных очевидно, что существуют четкие различия между этими двумя классами рецепторов.В настоящем исследовании мы обнаружили, что рецепторы группы III, но не группы II модулируют привыкание к зрительным реакциям. Кроме того, мы обнаружили, что величина эффектов антагонистов группы II на зрительные реакции зависит от степени зрительной стимуляции, чего нельзя сказать об использовании антагонистов группы III. Такие различия позволяют предположить специфическую функциональную роль этих рецепторов.

Роль рецепторов группы II

Данные с антагонистом группы II показывают, что рецепторы группы II могут активироваться эндогенным лигандом во время зрительной стимуляции.Эти рецепторы вряд ли расположены на окончаниях аксонов сетчатки (Koulen et al. 1996), но данные об экспрессии мРНК mGlu2 и mGlu3 показывают во всех слоях коры (Tanabe et al. 1993; Ohishi et al. 1993 a,b ), что указывает на возможность функциональных рецепторов группы II на корково-колликулярных афферентах. Таким образом, возможно, что ингибирующее действие агонистов группы II преимущественно связано с действием на окончания корково-колликулярных афферентов, таким образом, уменьшая зрительные реакции за счет ингибирования высвобождения глутамата.Имеются данные иммуногистохимии (Petralia et al. 1996; Kim & Jeon, 1999) и экспрессии (Ohishi et al. 1993 b ), указывающие на присутствие рецепторов группы II в SSC. Некоторые из этих рецепторов могут быть расположены на интернейронах, и возможно, что активация этих рецепторов может снизить ГАМКергическую передачу (Calabresi et al. 1992; Hayashi et al. 1993; Salt & Eaton, 1995; Cox & Sherman, 1999), тем самым вызывая облегчение зрительных реакций.Учитывая очень высокий уровень экспрессии mGlu3 в глии (Ohishi et al. 1993 b ; Testa et al. 1994; Jeffery et al. 1996; Petralia et al. 1994; 1999), также возможно, что имеется модулирующий эффект через рецепторы на глиальных клетках (Winder & Conn, 1996). Некоторые из этих возможностей указаны в .

Схематическая диаграмма, показывающая возможное расположение метаботропных рецепторов глутамата группы II и группы III в SSC и то, как они могут быть активированы глутаматом, высвобождаемым на перисинаптические рецепторы (закрашенные стрелки), или глутаматным «распространением» на экстрасинаптические рецепторы, расположенные вдали от высвобождения сайт (пунктирные стрелки).Обратите внимание, что предлагаемые возможности не претендуют на то, чтобы быть исчерпывающими.

Следует отметить, что эффект антагониста группы II меняется при изменении контраста стимула, тогда как у антагонистов группы III такого эффекта не наблюдается. Имеются данные о «внесинаптическом» расположении рецепторов группы II в нескольких областях мозга (Nusser et al. 1994; Lujan et al. 1997; Mineff & Valtschanoff, 1999), и было высказано предположение, что эти рецепторы активируется только при «выбросе» глутамата из основной синаптической области, возможно, в периоды интенсивной синаптической активности (Scanziani et al. 1997; Русаков и Кульманн, 1998; Дьюб и Маршалл, 2000; Митчелл и Сильвер, 2000). Такие экстрасинаптические рецепторы могут затем действовать либо как пресинаптические ауторецепторы, либо как гетеросинаптические рецепторы для уменьшения высвобождения медиатора, и можно было бы предположить, что антагонист будет иметь больший эффект в условиях высокой синаптической активности (Scanziani et al. 1997; Mitchell & Silver, 2000). Однако неясно, насколько это может быть связано с синаптической обработкой в ​​физиологических условиях.Наше обнаружение того, что влияние на зрительные ответы антагониста группы II варьируется в зависимости от интенсивности стимула в пределах физиологического диапазона, указывает на то, что экстрасинаптические рецепторы играют роль в синаптической обработке во время зрительных ответов. Примечательно, что контрастозависимое действие антагониста группы II наблюдалось как на нейронах, где агонист усиливал зрительные ответы, так и подавлял зрительные ответы. Рецепторы группы II, которые могут быть локализованы на интернейронах и глиальных клетках, обеспечивают подходящие мишени в таком механизме (11).Интересно, что для антагонистов группы III не было существенной разницы между их эффектами при низком и высоком контрасте стимула. Это предполагает, что участие рецепторов группы III в синаптической передаче в SSC не так сильно зависит от синаптической концентрации глутамата, а также может свидетельствовать о том, что рецепторы группы III имеют более «центральное» синаптическое расположение (Shigemoto et al. 1996; Ottersen). и Ландсенд, 1997).

Роль рецепторов mGlu группы III в реакции привыкания

Предыдущая работа этой лаборатории показала, что ГАМК B (но не ГАМК A ) рецепторы вносят вклад в процесс привыкания (Binns & Salt, 1997).В настоящем исследовании мы показали, что активация рецепторов группы III с помощью l-AP4 усиливает привыкание, тогда как антагонист группы III MPPG снижает привыкание. Имеются данные о высоких уровнях экспрессии мРНК mGlu4 в ганглиозных клетках сетчатки (Akazawa et al. 1994; Hartveit et al. 1995), и возможно, что это отражает функциональные рецепторы на окончаниях SC. Другие исследования предполагают, что рецепторы группы III также могут присутствовать на окончаниях корково-колликулярных афферентов (Kinzie et al. 1995; Охиши и др. 1995) и на собственных клетках SSC (Kinzie et al. 1995; Ohishi et al. 1995; Bradley et al. 1998). Поскольку эффекты l-AP4 и MPPG все еще очевидны в присутствии антагониста GABA B , маловероятно, что рецепторы, расположенные на интернейронах GABA, или их вход способствуют модуляции привыкания рецепторами группы III. Кроме того, реакция привыкания у кроликов, по-видимому, не зависит от коры головного мозга (Horn & Hill, 1966; Stewart et al. 1973), и, таким образом, возможно, что привыкание возникает, когда глутамат, высвобождаемый афферентными рецепторами сетчатки, активирует пресинаптические ауторецепторы mGlu, подавляя высвобождение глутамата и вызывая реакцию на привыкание. Однако, поскольку мы обнаружили, что агонист группы III не подавлял реакцию привыкания, возможно, рецепторы группы III каким-то образом модулируют привыкание, а не участвуют в нем напрямую. Дополнительным фактором может быть ингибирующее постсинаптическое действие рецепторов группы III (Martin et al. 1997; Сироне и Солт, 2000). Напротив, рецепторы группы II mGlu, по-видимому, не участвуют специфически в реакции привыкания, и это подтверждается отсутствием или низким уровнем рецепторов группы II, расположенных на окончаниях ганглиозных клеток сетчатки (Hartveit et al. 1995). . Активация афферентов сетчатки также обеспечивает глутаматергический импульс к ГАМКергическому тормозному интернейрону, который вызывает привыкание к ответу в SSC через рецепторы GABA B (Binns & Salt, 1997).Таким образом, привыкание к реакции генерируется комплементарными компонентами mGlu и GABA B .

Выводы

SC имеет решающее значение в интегративной обработке сенсорной информации с целью создания ориентировочных поведенческих реакций на новые сенсорные стимулы. Настоящие результаты указывают на то, что глутамат способен вызывать комплексные эффекты как в синапсе, так и вне синапсов, что может зависеть от ряда факторов, включая участие как ионотропных, так и метаботропных рецепторов, концентрацию глутамата в синапсах и степень диффузии медиатора.В частности, наши результаты показывают, что рецепторы mGlu играют важную роль в формировании свойств зрительного ответа нейронов в SSC и что рецепторы группы II и группы III играют разные функциональные роли. Мы показали, что рецепторы mGlu группы III вносят значительный вклад в привыкание к реакции, явление, которое, как считается, лежит в основе обнаружения новизны. Напротив, рецепторы mGlu группы II, по-видимому, играют особую роль в модуляции ответов при более высоких уровнях зрительной стимуляции, и это может обеспечивать дополнительный центральный механизм адаптации к высококонтрастным стимулам.

КореяМед Синапс

1. Стэнтон П.К. LTD, LTP и порог скольжения для долгосрочной синаптической пластичности. Гиппокамп. 1996 год; 6:35–42. PMID: 8878740.
2. Мелдрам Б.С. Глутамат как нейромедиатор в головном мозге: обзор физиологии и патологии. Дж Нутр. 2000 г.; 130 (4 Дополнение): 1007S–11015. PMID: 10736372.
3. Носырева ЭД, Хубер КМ. Переключение в развитии синаптических механизмов долговременной депрессии, зависящей от метаботропных глутаматных рецепторов гиппокампа. Дж. Нейроски. 2005 г.; 25:2992–3001.PMID: 15772359.
4. Бардони Р. Роль пресинаптических рецепторов глутамата в передаче боли на уровне спинного мозга. Курс Нейрофармакол. 2013; 11: 477–483. PMID: 24403871.
5. Шапиро М. Пластичность, клетки места гиппокампа и когнитивные карты. Арх Нейрол. 2001 г.; 58:874–881. PMID: 11405801.
6. Zhang J, Li Y, Xu J, Yang Z. Роль рецептора N-метил-D-аспартата при болезни Альцгеймера. J Neurol Sci. 2014; 339: 123–129. PMID: 24548486.
7. Амири А., Санчес-Ортис Э., Чо В., Бирнбаум С.Г., Сюй Дж., Маккей Р.М., Парада Л.Ф.Анализ делеции FMR1 в субпопуляции постмитотических нейронов в коре головного мозга и гиппокампе мыши. Аутизм рез. 2014; 7: 60–71. PMID: 24408886.
8. Стил Дж. В., Браутигам Х., Шорт Дж. А., Сова А., Ши М., Ядав А., Уивер С. М., Вестэуэй Д., Фрейзер П. Е., Сент-Джордж-Хислоп П. Х., Ганди С., Хоф П. Р., Дикштейн Д. Л. Ранние дефекты памяти о страхе связаны с измененной синаптической пластичностью и молекулярной архитектурой в мышиной модели болезни Альцгеймера TgCRND8. J Комп Нейрол. 2014; 522:2319–2335. PMID: 24415002.
9. Пак Дж. М., Ху Дж. Х., Милштейн А., Чжан П. В., Мур К. Г., Парк С., Датко М. С., Доминго Р. Д., Рейес К. М., Ван XJ, Эцкорн Ф. А., Сяо Б., Шумлински К. К., Керн Д., Линден Д. Д., Уорли П. Ф. Пролил-изомераза опосредует дофамин-зависимую пластичность и кокаиновую двигательную сенсибилизацию. Клетка. 2013; 154: 637–650. PMID: 236.
10. Чанг Л., Бей А.Л., Цзян Ю.Х. Синаптическая пластичность в мышиных моделях расстройств аутистического спектра. Корейский J Physiol Pharmacol. 2012 г.; 16: 369–378. PMID: 23269898.
11. Хур С.В., Парк Дж.М.Длительная потенциация возбуждающей синаптической силы в нейронах спиноталамического тракта спинного мозга крысы. Корейский J Physiol Pharmacol. 2013; 17: 553–558. PMID: 24381506.
12. Макдональд Дж. Ф., Джексон М. Ф., Бизли М. А. Долгосрочная синаптическая пластичность гиппокампа и усиление сигнала NMDA-рецепторов. Критический преподобный Нейробиол. 2006 г.; 18:71–84. PMID: 17725510.
13. Парк С., Парк Дж.М., Ким С., Ким Дж.А., Шеперд Дж.Д., Смит-Хикс С.Л., Чоудхури С., Кауфманн В., Куль Д., Рязанов А.Г., Хуганир Р.Л., Линден Д.Дж., Уорли П.Ф.Фактор элонгации 2 и ломкий белок умственной отсталости X контролируют динамическую трансляцию Arc/Arg3.1, необходимую для mGluR-LTD. Нейрон. 2008 г.; 59:70–83. PMID: 18614030.
14. Jang HJ, Cho KH, Park SW, Kim MJ, Yoon SH, Rhie DJ. Влияние серотонина на индукцию долговременной депрессии в зрительной коре крыс. Корейский J Physiol Pharmacol. 2010 г.; 14:337–343. PMID: 21165334.
15. Kim EC, Lee MJ, Shin SY, Seol GH, Han SH, Yee J, Kim C, Min SS. Форбол 12-миристат 13-ацетат усиливает долгосрочное потенцирование в гиппокампе посредством активации протеинкиназы Cδ и ε.Корейский J Physiol Pharmacol. 2013; 17:51–56. PMID: 23440225.
16. Пак Дж.С., Ю С.Б., Ким Дж.И., Ли С.Дж., О С.Б., Ким Дж.С., Ли Дж.Х., Пак К., Джанг Дж.В., Чхве С.И. Влияние потребления сахарина на пластичность гиппокампа и коры у молодых и подростковых крыс. Корейский J Physiol Pharmacol. 2010 г.; 14:113–118. PMID: 20473383.
17. Park SW, Jang HJ, Cho KH, Kim MJ, Yoon SH, Rhie DJ. Переключение серотонинергической роли в развитии синаптической долговременной потенциации в зрительной коре крысы.Корейский J Physiol Pharmacol. 2012 г.; 16:65–70. PMID: 22416222.
18. Heise C, Gardoni F, Culotta L, di Luca M, Verpelli C, Sala C. Фосфорилирование фактора элонгации-2 в дендритах и ​​регуляция трансляции дендритной мРНК в нейронах. Неврологи передней клетки. 2014; 8:35. PMID: 24574971.
19. Чо Р.В., Парк Дж.М., Вольф С.Б., Сюй Д., Хопф С., Ким Дж.А., Редди Р.С., Петралия Р.С., Перин М.С., Линден Д.Дж., Уорли П.Ф. mGlu-R1 / 5-зависимая длительная депрессия требует регулируемого расщепления эктодомена нейронального пентраксина NPR с помощью TACE.Нейрон. 2008 г.; 57:858–871. PMID: 18367087.
20. Турриджано Г.Г., Нельсон С.Б. Хебб и гомеостаз нейронной пластичности. Курр Опин Нейробиол. 2000 г.; 10: 358–364. PMID: 10851171.
21. Ху Д.Х., Пак Дж.М., Парк С., Сяо Б., Дехофф М.Х., Ким С., Хаяши Т., Шварц М.К., Хуганир Р.Л., Сибург П.Х., Линден Д.Дж., Уорли П.Ф. Гомеостатическое масштабирование требует активации mGluR группы I, опосредованной Homer1a. Нейрон. 2010 г.; 68:1128–1142. PMID: 21172614.
22. Анго Ф., Презо Л., Мюллер Т., Ту Дж. К., Сяо Б., Уорли П. Ф., Пин Дж. П., Бокарт Дж., Фагни Л.Агонист-независимая активация метаботропных глутаматных рецепторов внутриклеточным белком Гомер. Природа. 2001 г.; 411: 962–965. PMID: 11418862.
23. O’Riordan K, Gerstein H, Hullinger R, Burger C. Роль Homer1c в долговременном потенцировании, зависящем от метаботропных рецепторов глутамата. Гиппокамп. 2014; 24:1–6. PMID: 24167026.
24. Чоудхури С., Шеперд Д.Д., Окуно Х., Лайфорд Г., Петралия Р.С., Плат Н., Кул Д., Хуганир Р.Л., Уорли П.Ф. Arc/Arg3.1 взаимодействует с эндоцитарным механизмом, чтобы регулировать перенос AMPA-рецепторов.Нейрон. 2006 г.; 52:445–459. PMID: 17088211.

Глутаматные рецепторы (семейство G-белков)

Существование связанных с G-белком рецепторов глутамата (также называемых «метаботропными» глутаматными или mGlu), принадлежащих к семи трансмембранным охватывающим суперсемействам рецепторов, было окончательно показано при клонировании первого члена в 1991 г. С тех пор открыто восемь рецепторов этого класса. mGlu являются членами подгруппы рецепторов, связанных с G-белком, «класса C», отличающихся наличием большого N-концевого домена, который содержит сайт связывания ортостерического агониста.На основании исследований с mGlu1 предполагается, что эти рецепторы существуют в виде гомодимеров с N-концевым доменом, образующим структуру «раковины моллюска», состоящую из двух долей, соединенных шарнирной областью. Глутамат связывается между этими долями, чтобы стабилизировать закрытое состояние, которое вызывает конформационные изменения в трансмембранных областях гомодимера, способствуя связыванию с G-белком. Существование С-концевых вариантов сплайсинга для многих подтипов и внутриклеточных взаимодействующих белков (например, Homer, Pick-1) позволяет предположить, что функция рецептора mGlu подвергается сложной внутриклеточной регуляции.

Восемь рецепторов были разделены на три группы на основании сходства их аминокислотных последовательностей, связывания с G-белком и фармакологии. Группа I (mGlu1 и 5) связывается с G q и передает сигнал через расщепление инозитолфосфолипида, тогда как Группа II (mGlu2 и 3) и Группа III (mGlu4, 6, 7 и 8) связываются с G i/o и ингибируют аденил. циклаза. Кроме того, представители всех трех групп могут напрямую взаимодействовать с потенциалзависимыми кальциевыми или калиевыми каналами через свои G-белки.Существуют многочисленные фармакологические инструменты для этих рецепторов. К ним относятся несколько «селективных по группе» агонистов, в частности: висквалат и S-DHPG для группы I; 2R,4R-APDC и LY-354740 для группы II; а также Л-АП-4 и РС-ППГ для группы III. Аналогичным образом, было идентифицировано несколько «селективных по группе» антагонистов, а именно: LY393675 для группы I; LY341495 и MGS0039 для группы II; а также MAP4 и UPB1110 для группы III.

Также были описаны селективные по подтипу лиганды для некоторых рецепторов mGlu.В группе I селективные антагонисты для mGlu1 включают конкурентный антагонист LY-367385; и неконкурентные антагонисты CPCCOEt, R214127 и BAY63-7620. CHPG является селективным, но относительно малоэффективным агонистом рецепторов mGlu5, а селективные неконкурентные антагонисты включают MPEP, MTEP и DeMeOB. В группе II встречающийся в природе дипептид NAAG является селективным агонистом рецепторов mGlu3. Агенты, селективные к подтипам в группе III, были менее ожидаемы, хотя (S)-гомоАМРА является слабым, но селективным агонистом рецепторов mGlu6, а (S)-3,4-DCPG является мощным и селективным агонистом рецепторов mGlu8.

Интересным событием в фармакологии mGlu является открытие аллостерических модуляторов нескольких подтипов. Эти соединения связываются в 7-трансмембранных доменах, положительно или отрицательно модулируя активацию рецептора глутаматом. Таким образом действуют описанные выше селективные подтипы «неконкурентных антагонистов». Кроме того, были идентифицированы положительные аллостерические модуляторы (которые не активируют рецептор напрямую, но вызывают сдвиг влево на кривой доза-реакция агониста), например.ж.: Ro 67-7476 и Ro 01-6128 для mGlu1, CPPHA, DFB и CDPPB для mGlu5, LY-487379 для mGlu2 и PHCCC для mGlu4. Интересно, что также был идентифицирован «нейтральный» модулятор для mGlu5 (DCB), который блокирует действие положительных и отрицательных аллостерических модуляторов в этом подтипе без изменения связывания глутаматного сайта или активации рецептора. С терапевтической точки зрения аллостерические модуляторы являются привлекательным подходом, поскольку они обычно проявляют высокое сродство, превосходную селективность по подтипам, обладают лучшими «лекарственными» свойствами (например,грамм. проникновение через гематоэнцефалический барьер), чем аналоги глутамата, действующие в месте узнавания медиатора, и действовать, повышая или понижая действие глутамата на целевом подтипе в сочетании с высвобождением нейротрансмиттера.

В целом, все три группы глутаматных рецепторов, связанных с G-белком, широко распространены в ЦНС и имеют признаки постсинаптической, пресинаптической и, в некоторых случаях, глиальной локализации. Считается, что один или несколько рецепторов группы II и группы III функционируют как ауторецепторы, опосредуя высвобождение глутамата из его нервных окончаний.Пресинаптические рецепторы группы II и III непосредственно уменьшают высвобождение других нейротрансмиттеров (например, дофамина и ГАМК), действующих как гетеро-ауторецепторы. Напротив, пресинаптический рецептор группы I может способствовать высвобождению глутамата. Интересно, что вариант mGlu4 с укороченным N-концевым доменом существует во вкусовых рецепторах и, как предполагается, дает умами, характерный вкус глутамата натрия. Активация (предположительно) постсинаптических рецепторов группы I потенцирует функцию рецептора NMDA.Агонисты mGlu1 и mGlu5 и положительные аллостерические модуляторы были предложены в качестве нового подхода к лечению шизофрении, тогда как антагонисты этих подтипов были предложены в качестве потенциальных средств для лечения боли, наркомании, тревоги, болезни Паркинсона и ожирения, а также обладают нейропротекторные и противоэпилептические свойства. Агонисты рецепторов группы II и позитивные аллостерические модуляторы эффективны на животных моделях эпилепсии, тревоги и психоза, и сообщалось, что LY354740 эффективен у пациентов с генерализованной тревогой.Агонисты группы III и положительные аллостерические модуляторы эффективны на животных моделях эпилепсии, обладают нейропротекторным действием и устраняют двигательную дисфункцию на животных моделях болезни Паркинсона.

В таблице ниже приведены допустимые модуляторы и дополнительная информация. Список дополнительных продуктов см. в разделе «Похожие продукты» ниже.

Фармакологические доказательства гетеродимера метаботропного рецептора глутамата в нервных клетках

Рукопись была оценена компетентными рецензентами, которые дали положительные отзывы о результатах исследования гетеродимера mGluR2-4.Используя подход, основанный на FRET с временным разрешением, были получены убедительные доказательства гетеродимерного расположения mGlu2-4 в клетках HEK293 и первичных нейронах после экспериментов по трансфекции. Агонисты mGlu2 использовали для определения ответов и кооперативности гетеродимера Glu2-4 с определением коэффициента Хилла. Было выдвинуто несколько оговорок, в том числе;

1) Актуальность результатов для эндогенного рецептора;

Во-первых, наши данные показывают, что образование гетеродимеров mGlu2-4 не является следствием сверхэкспрессии этих субъединиц.Следует отметить, что уровни экспрессии как mGlu2, так и mGlu4 довольно низки в клеточной линии полосатого тела, так что с помощью обычных анализов вторичных мессенджеров невозможно измерить прямые ответы. Только при использовании анализа без метки можно измерить ответы mGluR.

Кроме того, наша количественная оценка трансфицированных рецепторов mGlu2 в нейронах гиппокампа выявила только 5-кратное увеличение рецепторов клеточной поверхности по сравнению с контролем.

Мы также сообщаем, что синергетический эффект, наблюдаемый в срезах гиппокампа, теряется у мышей mGlu4 KO, и что увеличение активности агониста mGlu2 LY354740, наблюдаемое при активации субъединицы mGlu4, не может быть воспроизведено путем активации коэкспрессируемого Gi- сопряженный дельта-опиоидный рецептор.Мы считаем, что наше исследование дает убедительные фармакологические доказательства существования гетеродимеров mGlu2-4 в клетках, естественным образом экспрессирующих эти рецепторы, и что это явление не является следствием сверхэкспрессии рецепторов. Мы согласны с тем, что требуется дополнительная работа для расшифровки физиологического значения таких гетеромерных сборок, но это не входит в рамки нашей настоящей рукописи, которая в основном сосредоточена на разработке анализов, направленных на характеристику гетеродимеров mGlu.

2) Необходимость дополнительных данных в нейронных системах, где обнаружены рецепторы mGlu2-4;

Добавлены данные о мышах mGlu4 KO, подтверждающие, что эффект LSP4-2022 опосредован субъединицей mGlu4.Как и ожидалось, синергетического эффекта между LY354740 и LSP4-2022 в отсутствие mGlu4 не наблюдается.

3) Ряд экспериментальных деталей необходимо прояснить и исправить на протяжении всей рукописи. Было сочтено, что уровень техники, материалы и методы требуют дополнительных пояснений, поскольку методы представляют собой новый способ демонстрации гетеромерных взаимодействий. Мы считаем, что большинство этих вопросов можно решить своевременно, и рекомендуем серьезно пересмотреть этот документ.Основные опасения перечислены ниже.

Раздел «Материалы и методы» дополнен максимальным количеством информации, чтобы любой читатель мог повторить эксперименты.

Отзыв №1:

Хотя анализ является убедительным, исследование было бы усилено, если бы эксперименты по трансфекции исключали эффекты гиперэкспрессии и пропуска локализации рецепторов.

1) Система экспрессии используется для отслеживания гетеродимеров mGlu2-4 на клеточной поверхности, но это не исключает внутриклеточной локализации рецепторов.Кроме того, сильные промоторы использовались для достижения высоких уровней экспрессии в HEK293 и первичных нейронах гиппокампа. Некоторое внимание следует уделить соответствующей клеточной экспрессии после трансфекции. Изображения на рисунках 5 и 6 являются адекватными, но не указывают, есть ли различия в субклеточной локализации после трансфекции.

В этом первом пункте рефери поднято много вопросов, которые мы проясним один за другим.

Что касается валидности системы контроля качества, используемой для обеспечения специфической экспрессии гетеродимеров mGlu2-4 на клеточной поверхности, важную информацию можно найти на рисунке 1 — дополнение к рисунку 3.На панели 3А показана экспрессия SNAP-mGlu4-C1 на клеточной поверхности по сравнению с SNAP-mGlu4 в зависимости от плазмидной ДНК, использованной при трансфекции. В используемых условиях поверхностная экспрессия SNAP-mGlu4-C1 составляет 0,4% от экспрессии SNAP-mGlu4 в наших экспериментальных условиях. На панели B показано, что совместная экспрессия SNAPmGlu4-C1 с CLIP-mGlu2-C2 приводит к значительному увеличению экспрессии SNAP-mGlu4-C1 на клеточной поверхности. В конце концов, панель C показывает, что очень низкие сигналы CLIP-CLIP и SNAP-SNAP TR-FRET, вероятно, возникают из-за FRET наблюдателя, а не FRET между субъединицами гомодимерных рецепторов, поскольку при активации рецептора специфическим агонистом не наблюдается снижения сигнала TR-FRET. , в отличие от того, что ожидается, если FRET происходит из гетеродимера.Мы изменили текст, чтобы сделать этот момент более понятным для читателей

Судья прав в том, что либо анализ (специфический для гетеродимера биосенсор, либо специфическое нацеливание гетеродимера на клеточную поверхность) проводят в присутствии внутриклеточных рецепторов. Однако при использовании биосенсора, поскольку мы использовали не проникающие в клетку субстраты CLIP и SNAP, можно пометить только рецепторы клеточной поверхности, несущие внеклеточные метки CLIP или SNAP. Только эти рецепторы клеточной поверхности затем будут зарегистрированы в любых биосенсорных анализах.Что касается сохранения ER конструкций C1 и C2, хотя они сохраняются внутриклеточно, и хотя некоторые авторы утверждают, что внутриклеточные mGluR могут передавать сигналы, нам никогда не удавалось измерить какую-либо передачу сигналов с конструкциями C1 или C2, экспрессируемыми отдельно при применении глутамата (Huang et al. и др., 2011 г., Брок и др., 2007 г.). Мы изменили текст, чтобы сделать этот момент более понятным для читателей.

Судья также ставит под сомнение возможность того, что представленные данные являются результатом чрезмерной экспрессии рецепторов.Мы не думаем, что это так по следующим причинам.

i) Взаимодействие между рецепторами клеточной поверхности может быть искусственно улучшено из-за сверхэкспрессии белков. Это хорошо иллюстрирует работа Calebiro et al., 2013, сообщающая, что доля димеров и олигомеров увеличивается с увеличением плотности рецепторов на поверхности клетки. В наших экспериментальных условиях, хотя мы можем измерить TR-FRET между субъединицами, мы не смогли измерить значимый сигнал в условиях, когда TR-FRET может быть результатом только близости между димерами (Maurel et al., 2008; Думазан и др., 2011). Более того, для оценки размера комплексов mGlu2-4 использовались различные экспериментальные протоколы, и все они соответствовали строгим гетеродимерам (Doumazane et al., 2011).

ii) Функциональные данные, полученные с клеточной линией полосатого тела (рис. 6), хорошо иллюстрируют

, что рецептор с фармакологическими свойствами гетеродимера mGlu2-4 может быть функционально обнаружен, тогда как эти клетки экспрессируют небольшое количество каждого рецептора, о чем свидетельствует сложность измерения ответа вторичного мессенджера при активации агониста.Следует отметить, что эти функциональные данные были получены в контрольных нетрансфицированных клетках, естественным образом экспрессирующих mGlu2 и mGlu4.

iii) Экспрессия рецептора mGlu2 в трансфицированных нейронах была количественно определена, и результаты этого исследования будут вскоре представлены в другом исследовании. Поскольку несколько процентов культивируемых нейронов трансфицируются в наших экспериментальных условиях, радиоактивные лиганды нельзя было использовать для количественной оценки экспрессии рецептора mGlu2. Затем мы воспользовались преимуществом специфического для mGlu2 нанотела (публикация представлена), помеченного флуорофором, для сравнения флуоресцентного сигнала в нетрансфицированных нейронах и в трансфицированных нейронах.Данные представлены на изображении ответа автора 1 и показывают, что средняя экспрессия рецепторов mGlu2 в 5 раз выше базовой экспрессии в нетрансфицированных нейронах. В исследовании мы также приводим доказательства того, что гомодимеры mGlu2, несмотря на в 5 раз более высокую экспрессию, не образуют более крупных комплексов в контрольных условиях, оставаясь строгими димерами, что еще раз показывает, что ассоциация mGlu2-4, наблюдаемая в настоящем исследовании, маловероятна в результате слишком высокая экспрессия субъединиц.

Перекрытие между уровнями экспрессии mGlu
2 в нативных и трансфицированных нейронах.

Экспрессию рецептора mGlu 2 в нативных и трансфицированных первичных нейронах гиппокампа измеряли с помощью иммунофлуоресценции с использованием меченого d2 однодоменного антитела (DN1-d2), специфичного к рецептору mGlu 2 . ( A ) Схематическое изображение мечения DN1-d2 рецептора mGlu 2 . ( B ) Пример меченого DN1-d2 нативного нейрона с эндогенной экспрессией рецептора mGlu 2 .( C ) Средняя интенсивность мечения DN1-d2 нейронов с экспрессией эндогенного рецептора mGlu 2 (28 клеток) или трансфицированных рецептором mGlu 2 (26 клеток). Эндогенная экспрессия mGlu 2 перекрывается с экспрессией в трансфицированных нейронах в диапазоне 55-170 субъединиц/V eff (заштрихованная область).

https://doi.org/10.7554/eLife.25233.029

Для обсуждения этой проблемы был добавлен специальный абзац в Обсуждение.

Последний аспект, затронутый в этом первом пункте рефери, относится к субклеточной локализации рецепторов. Как показано на рис. 5, трансфицированные субъединицы обнаруживаются в большинстве компартментов нейронов, тогда как рецепторы как mGlu2, так и mGlu4, как ожидается, в основном нацелены на окончания. Однако при использовании нашего конкретного нанотела mGlu2 (Европейская патентная заявка EP3164415, Scholler et al., находится на пересмотре) рецепторы mGlu2 можно было идентифицировать в нескольких нейронах гиппокампа с широким распределением маркировки по всему нейрону (см. 2), как это наблюдается с трансфицированными рецепторами (фиг. 5).Однако основной целью этой части нашей работы было выяснить, могут ли гетеродимеры mGlu2-4 обнаруживаться в клетках, которые эндогенно экспрессируют эти субъединицы. Мы думаем, что наши данные иллюстрируют, что это действительно так, с вышеупомянутым ограничением.

Данные, показанные на рис. 6, относятся к контрольным клеткам, а не к трансфицированным клеткам, поэтому здесь нет особых проблем, связанных с локализацией пропуска из-за трансфекции.

2) Линия клеток полосатого тела SThdHQ7 используется для отслеживания рецепторов mGlu2-4.Почему клетки сморщиваются после активации аденилатциклазы (раздел «Результаты»)? Нет хорошего объяснения тому, почему выбраны именно эти клетки. Каково отношение mGlu2-4 к нарушениям полосатого тела, таким как болезнь Гентингтона?

Форсколин вызывает сокращение нескольких клеточных линий. Действительно, форсколин является одним из классических компонентов коктейлей для дифференцировки (Experimental & Molecular Medicine (2004) 36, 52–56; BMC Cell Biol. 2010 Apr 16;11:25). STHdh можно дифференцировать с помощью коктейля, содержащего форсколин.Во время наших первоначальных исследований с этими клетками и поиска ингибирования mGlu2 или mGlu4 индуцированной форсколином продукции цАМФ мы пришли к этому интересному наблюдению, которое можно легко проследить с помощью системы без меток Xcelligence. Затем мы использовали эту характеристику для оценки активации белка Gi агонистами mGlu2 и mGlu4.

Клетки

STHdh хорошо охарактеризованы и широко используются в качестве модели нейронов. Эти клетки экспрессируют различные ключевые белки, экспрессируемые в нейронах полосатого тела (DARPP-32, PSD95, D1, EAAT…).При поиске линии нейрональных клеток для проверки возможного образования гетеродимеров mGlu24 мы выбрали эти клетки в качестве альтернативы культивируемым нейронам, поскольку такие клетки легче трансфицировать. Следует отметить, что известно, что mGlu4 экспрессируется в некоторых нейронах полосатого тела (тех, которые проецируются в бледный шар) (Beurrier et al., 2009). Хотя рецепторы mGlu2 обнаружены в стриатуме (Wright et al., 2013), они в основном соответствуют пресинаптическим рецепторам в корково-стриарных окончаниях (Ohishi et al., 1993; Conn et al., 2005), поскольку слабый сигнал гибридизации in situ может быть обнаружен в клетках полосатого тела (Ohishi et al., 1993; Gu et al., 2008).

Затем мы проверили, можно ли обнаружить в этих клетках опосредованные mGlu2 и/или mGlu4 ответы, и это было так, используя чувствительный анализ без метки.

Эти клетки были в первую очередь выбраны в качестве модели нейронных клеток, а не модели нейронов полосатого тела с возможностью выдвинуть гипотезу о роли гетеродимера mGlu2-4 в сети базальных ганглиев и их возможном использовании для лечения болезней Гентингтона или Паркинсона.Мы думаем, что прежде чем приступить к такому обсуждению, потребуется более комплексная работа с более естественной ситуацией.

3) Как определяется «минимальная утечка соответствующих гомодимеров»? Было бы полезно определение «ортостерического сайта связывания» mGluR (подраздел «Активация обеих субъединиц в рецепторе mGlu2-4 необходима для полной активности» » ).

На Рисунке 1 (дополнение к рисунку 3A и 3B) определены уровни SNAP-mGlu4 и CLIP-mGlu2 на поверхности клеток.На поверхности клеток не наблюдалось значительного количества CLIP-mGlu2 C2KKXX в соответствии с нашими предыдущими исследованиями (Doumazane et al., 2011; Huang et al., 2011), и поэтому эти данные не были включены. Теперь мы ссылаемся на нашу предыдущую работу в основном тексте. Однако была обнаружена экспрессия 0,4% SNAP-mGlu4C1KKXX по сравнению с SNAP-mGlu4 WT, как показано на рисунке 1 — дополнение к рисунку 3. Это считалось «минимальной утечкой».

Ортостерический сайт — это сайт, в котором связывается природный лиганд, в отличие от аллостерического сайта, определяемого как сайт, отличный от ортостерического сайта (Christopoulos et al., Pharmacol Rev 2014). Чтобы прояснить вопрос, мы заменили «ортостерический» на «глутаматный», чтобы неспециалисты поняли, что мы мутировали сайт связывания, где связывается природный лиганд.

4) Стехиометрия многих других рецепторных систем была установлена ​​в результате экспериментов по аффинному сшиванию. Учитывая все инструменты, доступные в лаборатории, это доступный эксперимент, который предоставит больше доказательств в пользу гетеродимерной модели.

Хотя мы согласны с тем, что эксперименты по сшиванию могут быть информативными, такие эксперименты также подвергаются резкой критике, поскольку для сшивания может быть достаточно кратковременной ассоциации.Соответственно сшитые частицы будут накапливаться в течение всего эксперимента по сшиванию. Хороший пример описан в нашей недавней статье (Xue et al., Nat Chem Biol 2015), где можно наблюдать сшивку между димерами mGlu2, если они находятся в активной форме. Такое сшивание приводило к появлению FRET между димерами. Однако такой FRET не мог быть обнаружен без сшивания, что указывает на то, что только очень небольшая часть димеров была связана в более крупные комплексы в контрольных условиях и что такие комплексы накапливались при сшивании.

Для нас лучшей иллюстрацией того, что mGlu2 и mGlu4 связываются в гетеродимеры, а не между двумя гомодимерами, является большое изменение FRET при активации рецептора, иллюстрирующее, что FRET действительно возникает из-за специфической ассоциации субъединиц, как это наблюдается с гомодимеры. Кроме того, в нашем предыдущем исследовании (Doumazane et al., 2011) мы использовали несколько подходов, чтобы продемонстрировать, что mGlu2 и mGlu4 образуют гетеродимеры на поверхности клетки, а не более крупные комплексы.Теперь мы ссылаемся на это предыдущее исследование в нашей пересмотренной рукописи.

Рецензент №2:

В этой рукописи авторы исследуют гетеродимеризацию между типами метаботропных рецепторов глутамата в модулировании активности рецепторов. Большинство исследований проведено с рекомбинантными рецепторами — хотя исследования являются надежными и касаются важного вопроса, были предприняты поверхностные попытки охарактеризовать нативные рецепторы. Авторы используют главным образом гетерологичные или нейрональные клеточные линии и методы, основанные на FRET, для изучения изменений в движении рецепторов при связывании лиганда.Они продолжают исследовать регуляцию передачи сигналов, измененную этим процессом. Исследования хорошо продуманы и выполнены, а выводы основаны на достоверных данных. В целом, большинство исследований проводится с рекомбинантными рецепторами, экспрессированными в гетерологичных клетках или культивируемых нейронах. Хотя исследования являются надежными и затрагивают важный вопрос в этой области, насколько релевантна эта информация для нативного рецептора в эндогенных условиях. недостаточно хорошо изучены.

1) Заголовок – в том виде, в каком он написан, заголовок представляет собой широкомасштабное утверждение, которое рассматривается лишь частично и поэтому вводит в заблуждение.

Заголовок был изменен следующим образом: «Фармакологическое свидетельство гетеродимеров нативных метаботропных рецепторов глутамата в нервных клетках»

Мы по-прежнему считаем, что данные, полученные с линией нейрональных клеток, подтверждают существование нативного гетеродимера mGlu2-4 в нетрансфицированных клетках. Хотя наши данные о срезах гиппокампа не являются полностью убедительными, как обсуждалось с рефери №3, тем не менее они согласуются с нашим предложением. Действительно, такой сильный синергизм между агонистами Gi-связанных рецепторов никогда не наблюдался посредством сигнального синергизма.Поскольку наше исследование было в первую очередь направлено на установление инновационных подходов к изучению свойств гетеродимеров mGlu, и поскольку идентифицированные свойства можно наблюдать в клетках, естественным образом экспрессирующих как mGlu2, так и mGlu4, мы считаем, что наше новое предложенное название является подходящим.

2) Аннотация – написана в довольно общих чертах и ​​читается как заключение, а не краткий обзор исследования. Было бы полезно расширить резюме, включив в него немного больше информации об основных выводах исследования.

Мы по-прежнему считаем информацию, изложенную в аннотации, необходимой для широкого круга читателей. К сожалению, Аннотация не может быть расширена из-за ограничений по длине.

3) Материалы и методы. В этот раздел необходимо включить более подробную информацию, а некоторые важные детали отсутствуют; например, подробности о рецепторах (включая виды), трансфицированных в нейроны, здесь не включены (они появляются в подписи к рисунку). Как были созданы, охарактеризованы и независимо протестированы ER-сохраняющие рецепторы, так что на клеточной поверхности появляются только гетеромеры, неясно.Авторам рекомендуется показать эти данные, поскольку это укрепит их аргумент о том, что на поверхности клетки экспрессируются только гетеромеры. Это всего лишь пара примеров, и авторы должны тщательно просмотреть каждый из экспериментов в рукописи, чтобы убедиться, что все методы четко описаны, а не заставлять читателя переходить от материалов и методов к подписи к рисунку. раздел.

Нам очень жаль, что мы не проверили внимательно раздел «Материалы и методы» перед отправкой нашей рукописи.Мы благодарим рефери за указание на все эти недостающие части. Раздел «Материалы и методы» теперь дополнен и включает все детали, запрошенные рецензентом. Элементы управления с использованием конструкций, сохраняющих ER, можно найти на рисунке 1 — дополнение к рисунку 3, как подробно описано ранее.

Результаты

1) Подраздел «Датчик на основе FRET для идентификации mGlu2-4-специфических отпечатков пальцев » : Как видно из написанного, концентрации субстратов SNAP-донора и CLIP-акцептора, которые давали сигнал для гетеромера, не давали TR Сигнал -FRET с соответствующими гомомерами рецептора – так ли это? Это необходимо уточнить в рукописи.

При использовании в качестве субстратов SNAP-донора и CLIP-акцептора гомодимеры, состоящие из двух SNAP-меченых субъединиц, несут только донор, так что сигнал FRET не генерируется. Точно так же гомодимер с меткой CLIP помечен только акцептором и также не будет генерировать сигнал FRET. Тогда, как указано в тексте, только гетеродимер, состоящий из одной субъединицы, помеченной SNAP, и другой субъединицы, помеченной CLIP, будет помечен как донором, так и акцептором, так что сигналы TR-FRET будут генерироваться только гетеродимер.Это не означает (как следует из комментария рецензента), что гомомеры не могут быть образованы, а просто то, что наши экспериментальные условия позволяют отслеживать сигналы FRET, исходящие исключительно от гетеромеров.

Этот момент прояснился в нашей переработанной рукописи.

2). В том же подразделе, абзац второй: Фигура 1А представляет собой схематическое изображение того, как помечаются гомомеры и гетеромеры; на этом рисунке не показано уменьшение TR-FRET, как это описано в тексте.Необходимо ссылаться на соответствующие панели, показывающие фактические данные (а не на схему).

Это исправлено.

3) Таблица с потенциями, эффективностью, коэффициентом Хилла с различными лигандами в клетках, экспрессирующими гомомеры и гетеромеры, была бы полезна, поскольку она позволила бы читателю сравнить изменения вместо того, чтобы просматривать различные цифры, чтобы проверить утверждения, сделанные в тексте.

Запрошенная Таблица добавлена ​​(Таблица 1).

4)Рисунок 7 содержит одну панель, которая показывает физиологическую значимость результатов этого исследования.Комбинация агонистов (хотя и при одной концентрации каждого) дает более чем аддитивный ответ по сравнению с ответами на отдельные агонисты. Однако планки погрешностей высоки, и неясно, сколько клеток было исследовано и от скольких животных (это должно быть указано в подписи к рисунку). В подписи к рисунку не указано количество (n) независимых опытов.

Запрошенная информация добавлена ​​в рисунок и легенду рисунка.

5) Кроме того, кривая доза-эффект LY34540 (или LSP4-2022) в присутствии низкой дозы LSP4-2022 (или LY34540) усилила бы этот критический момент.

Трудно построить кривую доза-эффект в препарате среза. Вместо проведения этих экспериментов мы предпочли получить данные из срезов, приготовленных из нокаутированных мышей mGlu4 (см. исправленную фигуру 7).

6) Рисунок 1 — дополнение к рисунку 1A-C, что означают разные цвета на графиках. Как они помогают отличать гомомерные сигналы от гетеромерных?

Цвета связаны с интенсивностью FRET (цветовая шкала, чем выше FRET — красный, а ниже — темно-синий).Мы хотим прояснить, что три графика были созданы из одного и того же набора клеток, трансфицированных различным количеством CT-mGlu2 и SNAP-mGlu4. График TOP показывает данные FRET после мечения CLIP как донорным, так и акцепторным субстратами. Он показывает наилучшие условия, приводящие к большому количеству гомодимеров mGlu2. На среднем графике представлены данные после мечения клеток донорными и акцепторными субстратами SNAP. Он показывает наилучшие условия для получения большего количества гомодимеров mGlu4. На нижнем графике показаны данные после мечения клеток донорным субстратом SNAP и акцепторным субстратом CLIP.Затем этот нижний график показывает наилучшие условия для получения большей доли гетеродимеров mGlu2-4. Сравнивая три графика, можно определить условия, благоприятствующие экспрессии гетеромера по отношению к каждому из гомодимеров. Легенда рисунка была изменена.

7.)Имеется несоответствие между названием рисунка и легендой рисунка – просьба к авторам внимательно проверить это. Например, легенда на Рисунок 1 — дополнение к рисунку 1A говорит mGlu4, но название рисунка говорит mGlu2, легенда для Рисунок 1 — дополнение к рисунку 1B говорит mGlu2, но название рисунка говорит mGlu4.Аналогично в . Рисунок 1 — дополнение к рисунку 2A и B. В заголовке на рисунке указано «агонист mGlu2», но в разделе «Результаты» указано «агонист mGlu4».

Мы благодарим рефери за указание на эти ошибки. Они были исправлены.

8) Самое главное, не исследованы ни совместная локализация двух рецепторов в этой системе, ни отсутствие синергизма у животных, у которых отсутствует один из рецепторов.

Эксперименты проводились на срезах, полученных от мышей mGlu4 KO.Данные теперь включены в исправленную фигуру 7. Данные показывают, что эффект LSP4-2022 теряется в этих срезах, что указывает на участие mGlu4. Напротив, эффект LY354740 остается неизменным. Мы также обнаружили, что LSP4-2022 больше не усиливает действие LY354740 в отсутствие mGlu4.

Что касается исследований совместной локализации, известно, что mGlu2 и mGlu4 экспрессируются в этих окончаниях, и наши данные подтверждают это, поскольку и LY354740, и LSP4-2022 ингибируют передачу.Для проведения исследований совместной локализации нам потребуется больше времени, особенно потому, что для их действительно значимого использования потребуется электронная микроскопия. Мы думали, что такие исследования выходят за рамки настоящего исследования, концентрируясь на оригинальных подходах, специально предназначенных для изучения фармакологических свойств гетеродимеров mGlu. Мы также предпочли сосредоточиться на времени, доступном для создания пересмотренной рукописи, на характеристике срезов mGlu4 KO.

Рецензент №3:

В этой рукописи представлены очень хорошие данные в поддержку гетеродимерных рецепторов mGlu2-mGlu4.Эксперименты FRET убедительны и демонстрируют, что фармакологию геродимеров можно отличить от фармакологии любых гомодимеров. Во-вторых, авторы показывают, что некоторые соединения обладают различными действиями на герродимеры по сравнению с гомодимерами, такими как разные коэффициенты Хилла или частичная агонистическая или синергетическая активность. Наконец, эксперименты по измерению набухания клеток клеточной линии культивируемых полосатых нейронов в качестве показателя активации аденилатциклазы являются инновационными и показывают синергетическую активность BINA и VU0415374 в нейронах.Мой единственный вопрос об этой рукописи заключается в том, что наличие гетеродимеров mGlu2-4 в латеральном перфорантном пути является наиболее наводящим, но не окончательным. Показанные синергетические эффекты могут быть вызваны нижестоящими рецепторами в Gi-связанных путях. Учитывая фармакологические отпечатки пальцев, представленные на рисунках 4 или 6, можно ли провести аналогичные эксперименты на срезах гиппокампа?

Судья прав, нельзя исключать возможность синергетического эффекта между двумя сопряженными Gi рецепторами, хотя до сих пор о таком синергизме не сообщалось.Поэтому мы модифицировали нашу рукопись, чтобы свести к минимуму наш вывод о существовании гетеродимеров mGlu2-4 в окончаниях перфорантного пути и, скорее, заявить, что наши данные согласуются с присутствием таких гетеродимеров. Чтобы сделать более убедительный вывод, мы стремились изучить в рекомбинантных системах возможные синергетические эффекты между гомодимерами mGlu2 и mGlu4. Хотя с биосенсорами TR-FRET такого синергизма обнаружить не удалось (фармакологические свойства mGlu2, показанные на рисунке 1, измеряли в присутствии mGlu4 и mGlu2-4), такое наблюдение не исключало синергетического действия после активации рецептора.

Затем мы стремились к экспрессии гомодимеров mGlu2 и mGlu4 в клетках без присутствия гетеродимеров mGlu2-4. Теоретически это было возможно при использовании mGlu2C1, mGlu2-C2 и mGlu4. Мы ожидали, что совместная трансфекция этих трех конструкций приведет к гомодимерам mGlu2 и mGlu4 только на клеточной поверхности, поскольку ни гетеродимеры mGlu2-C1-mGlu4, ни mGlu2-C2-mGlu4 не должны были достичь клеточной поверхности из-за присутствия Сигнал удержания ER в хвостах C1 и C2. К сожалению, эти две комбинации были обнаружены в достаточном количестве на клеточной поверхности, что не позволяет провести анализ возможного синергетического эффекта между гомодимерами mGlu2 и mGlu4.Затем мы совместно экспрессировали mGlu2 и Gi-связанный δ-опиоидный рецептор (DOR) и исследовали, может ли активация DOR усиливать эффект агониста mGlu2 в ингибировании индуцированного форсколином образования цАМФ с использованием pGlo-сенсора. Как показано на Фигуре 6 (дополнение 2 к фигуре), потенцирования обнаружено не было, несмотря на эквивалентную экспрессию обоих рецепторов и правильное связывание обоих рецепторов с ингибированием образования цАМФ.

Хотя эти дополнительные данные не являются исчерпывающими, мы считаем, что они укрепляют нашу точку зрения.

Что касается последних комментариев рефери, хотя мы согласны с тем, что такие эксперименты были бы замечательными, они довольно сложны, отнимают много времени и дороги с точки зрения количества препарата, необходимого для получения полной кривой доза-реакция с использованием электрофизиологических записей в головном мозге. ломтики. Затем мы предпочли сконцентрировать нашу работу на получении данных с мышами mGlu4 KO.

https://doi.org/10.7554/eLife.25233.032

Активация метаботропных рецепторов глутамата защищает нервные клетки от окислительного стресса

Резюме

Метаботропные рецепторы глутамата (mGluR) участвуют в различных клеточных реакциях на глутаминовую кислоту.Работа, описанная в этой рукописи, расширяет роль mGluR, включая защиту от запрограммированной гибели клеток, вызванной окислительным стрессом. Аналоги глутамата регулируют накопление массы инозитол-1,4,5трифосфата в соответствии с их способностью защищать клетки от окислительной токсичности глутамата, причем защита, по-видимому, происходит на уровне метаболизма глутатиона. Кратковременное воздействие на клетки низких концентраций глутамата снижает чувствительность клеток к последующему воздействию глутамата. Воздействие глутамата повышает экспрессию mGluR5 в клетках гиппокампа HT-22 и mGluR1 в первичных культурах коры головного мозга.Наконец, агонисты mGluR группы I также защищают клетки от программ гибели, инициированных глюкозным голоданием и лишением цистина.

Идентификация семейства метаботропных рецепторов глутамата (mGluR) значительно расширила потенциальные клеточные реакции на глутамат в нервной системе (Nakanishi, 1994). Эксперименты, основанные главным образом на использовании селективных агонистов и антагонистов mGluR, показали, что эти рецепторы играют роль в синаптической пластичности (Bashir et al., 1993; Manzoni et al., 1994; Riedel and Reymann, 1996), судорожной активности (Thomsen et al., 1994) и эксайтотоксичности (Bruno et al., 1995a,b). Восемь mGluR представляют собой белки, связанные с G-белком, которые были разделены на три подгруппы на основе гомологии последовательностей и фармакологических свойств. Рецепторы группы II (mGluR 2 и 3) и группы III (mGluR 4, 6, 7 и 8) связаны с семейством G-белков G i и G o , тогда как группа I (mGluR 1 и 5 ) рецепторы соединяются с G q/11 .mGluR группы I активируют фосфолипазу C (PLC) с образованием инозитол-1,4,5-трифосфата (IP 3 ) и диацилглицерола, которые играют несколько ролей «вторичных мессенджеров» (Nakanishi, 1994; Joly et al., 1995; Pin and Дювуазен, 1995). Напротив, рецепторы групп II и III ингибируют аденилатциклазу и модифицируют активность ионных каналов (Nakanishi, 1994; Buisson and Choi, 1995; Pin and Duvoisin, 1995). Однако вполне вероятно, что многие роли mGluRs в нервной системе еще предстоит открыть.

Помимо активации ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов, третий способ влияния глутамата на клеточный метаболизм заключается в его взаимодействии с цистин-глутаматным антипортером, что приводит к истощению внутриклеточного цистеин-цистеина и снижению цистеин- содержащие трипептид глутатион (GSH) (Murphy et al., 1989). Вызванное глутаматом истощение GSH приводит к окислительному стрессу и, в конечном итоге, к гибели клеток. Поскольку вызванная глутаматом гибель клеток может быть блокирована различными антиоксидантами, это явление известно как окислительная токсичность глутамата (Murphy et al., 1989).

Превосходной моделью окислительной токсичности глутамата является линия клеток гиппокампа HT-22. В этой иммортализованной клеточной линии мыши отсутствуют ионотропные рецепторы глутамата (Maher and Davis, 1996), и она реагирует на окислительную токсичность глутамата формой запрограммированной гибели клеток, отличной от классического апоптоза (Tan et al., 1998а). Сигнальный путь, ведущий к гибели клеток, включает снижение уровня GSH (Davis and Maher, 1994), активацию 12-липоксигеназы (Li et al., 1997a), накопление внутриклеточных пероксидов (Tan et al., 1998b), и активация cGMP-зависимого канала Ca 2+ в точке, близкой к концу каскада смерти (Li et al., 1997b). Ряд факторов защищает клетки от окислительной токсичности глутамата, включая антиоксиданты (Murphy et al., 1989; Davis and Maher, 1994), факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (Schubert et al., 1992) и активации протеинкиназы С (Davis and Maher, 1994). Поскольку по крайней мере одна группа mGluR связана с фосфолипазой C для образования вторичных мессенджеров IP 3 и диацилглицерина (Nakanishi, 1994), а также поскольку диацилглицерин активирует протеинкиназу C, из этого следует, что mGluR могут мешать путь передачи сигнала, ведущий к глутамат-индуцированной гибели клеток. Следующие эксперименты показывают, что активация mGluR в клетках HT-22 и культурах нейронов коры головного мозга крысы защищает клетки от глутаматной токсичности и других форм стресса.Эти данные указывают на новую нейропротекторную роль mGluR, которая может помочь поддерживать жизнеспособность клеток в ЦНС в присутствии избытка глутамата.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток и исследования токсичности. Линия нервных клеток гиппокампа НТ-22 является субклоном НТ4 (Morimoto and Koshland, 1990). Клон HT-22 был выбран из-за его чувствительности к токсичности глутамата. Клетки не обладают активными ионотропными рецепторами глутамата и не подвержены эксайтотоксичности (Maher, Davis, 1996).Клетки НТ-22 размножают в среде DMEM (Vogt and Dulbecco, 1963) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Выживаемость клеток определяли с помощью анализа MTT [3-(4,5-диметилдиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид], как описано (Schubert et al., 1992), который в этой клеточной системе коррелирует с гибель клеток, определяемая по исключению трипанового синего и анализу на образование колоний (Davis and Maher, 1994). Вкратце, клетки HT-22 диссоциируют с панкреатином (Life Technologies, Gaithersburg, MD) и высевают на 96-луночные планшеты для микротитрования в 5% диализированной эмбриональной бычьей сыворотке с плотностью 2.5×10 3 клеток на лунку в 100 мкл среды. На следующий день клетки обрабатывают различными реагентами согласно схеме эксперимента. Через 20 ч после добавления глутамата в каждую лунку добавляют по 10 мкл раствора МТТ (2,5 мг/мл) и клетки инкубируют 4 ч при 37°С. Затем в лунки добавляют солюбилизирующий раствор (100 мкл; 50% диметилфамид и 20% SDS, pH 4,8) и на следующий день измеряют значения поглощения при 570 нм. Результаты выражены относительно контролей, указанных в каждом эксперименте, и подвергнуты статистическому анализу (критерий Стьюдента t ).

Первичные нейроны коры получали из эмбриональных крыс Sprague Dawley на 17-й день, как описано (Abe et al., 1990). Клетки отделяли от коры и поддерживали в МЕМ с добавлением 30 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата и 10% фетальной телячьей сыворотки. Для исследований токсичности клетки высевали на покрытые полилизином 96-луночные планшеты для микротитрования по 50 000 клеток/100 мкл в каждой лунке и подвергали описанным обработкам через 24 часа после первоначального посева. Влияние различных реагентов на токсичность глутамата оценивали визуально путем подсчета клеток и исключения трипанового синего.Результаты выражены относительно необработанных контролей.

Определение цАМФ. клеток HT-22 высевали в количестве 2×10 5 клеток/60 мм чашки для тканевых культур в DMEM и 5% DFC. Через двадцать часов исходную среду заменяли предварительно нагретой DMEM, 5% DFC и 1 мМ IBMX. Затем добавляли тестовые реагенты. Через 10 мин клетки промывали холодным PBS и лизировали 0,1 н. HCl в этаноле. Клетки соскабливали с чашки, центрифугировали при 20 000 × g в течение 10 минут, и содержание цАМФ измеряли с помощью набора для радиоиммунного анализа (Amersham, Cleveland, OH) и цАМФ нормализовали к клеточному белку.

Определение фосфоинозитола. Клетки высевали в чашку для тканевых культур 2 × 10 5 /60 мм. Через 20 ч добавляли тест-реагенты на 15 с при 37°С, после чего клетки дважды промывали ледяным PBS, содержащим 10 мМ LiCl. Затем к культурам добавляли 10-процентную трихлоруксусную кислоту (ТХУ) и чашки помещали на лед на 15 мин. После высокоскоростного центрифугирования супернатант ТХУ экстрагировали двумя объемами холодного фреона; октиламин (4:1 по объему) и водную верхнюю фазу сохраняли.Массовые анализы IP 3 проводили с использованием анализа IP 3 бычьего связывающего белка (Challiss et al., 1993), поставляемого в виде набора компанией Amersham.

Поглощение цистина. Поглощение цистина измеряли в соответствии с Murphy et al. (1989). Клетки однократно промывали предварительно подогретым (37°C) HBSS и инкубировали с 0,5 мл того же раствора в течение 5 мин. Затем клетки промывали, как и раньше, и заменяли 250 мкл HBSS, содержащего 70 мкл-[ 35 S]цистина (40–250 мКи/ммоль; Амершам, Кливленд, Огайо).После инкубации при 37°С в течение 45 мин среду поглощения отсасывали, клетки трижды быстро промывали холодным HBSS и лизировали 200 мкл 0,5 М NaOH. Сто микролитров использовали для определения радиоактивности, а оставшуюся часть использовали для определения белка. Скорость поглощения была линейной до 60 мин. Результаты сначала выражали в виде количества 35 S, включенного в миллиграмм белка, а затем преобразовывали в процентное содержание ложнообработанного образца в каждом испытании.

Общий внутриклеточный GSH–дисульфид GSH. Клетки дважды промывали ледяным PBS, собирали соскобом и лизировали 10% сульфосалициловой кислотой. Лизаты инкубировали на льду в течение 10 мин, супернатанты собирали после центрифугирования в микроцентрифуге Eppendorf. При нейтрализации супернатантов триэтаноламином концентрацию общего глутатиона (восстановленного и окисленного) определяли методом, первоначально описанным Tietze (1969) и модифицированным Griffith (1980).Для получения стандартной кривой использовали чистый GSH.

Анализ mGluR. клетки собирали непосредственно в 1× буфере Лэммли (Laemmli, 1970). Клеточные лизаты разделяли в 10% полиакриламидных гелях, содержащих SDS, и электрофоретически переносили на поливинилидендифторидные гибридизационные мембраны (Micron Separations Inc., Westboro, MA). Мембрану сначала исследовали кроличьей антисывороткой в ​​разведении 1:2000, а затем вторичным антителом козы против кроличьего IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена, в разведении 1:20000.Конъюгаты антител обнаруживали с использованием набора для хемилюминесцентного вестерн-блоттинга (Amersham, Buckinghamshire, England).

Измерение активных форм кислорода. Внутриклеточное накопление активных форм кислорода (АФК) определяли с помощью 2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетата (H 2 DCF-DA) (Bass et al., 1983). Вкратце, клетки HT-22 высевали в чашку 2,5×10 5 /60 мм и через 12 часов либо имитировали обработку, либо обрабатывали указанными концентрациями глутамата и других агентов.Еще через 12 часов образцы диссоциировали из культуральных чашек с панкреатином в среде DMEM, содержащей 10 мкМH 2 DCF-DA, в течение 10 минут при 37°C и один раз промывали средой DMEM комнатной температуры (без фенолового красного) с добавлением 2% диализированного FCS. Использование панкреатина не влияло на исход экспериментов с проточной цитометрией, что было подтверждено флуоресцентной микроскопией. Конечная клеточная суспензия содержала 10 мкг/мл йодида пропидия (PI). Проточный цитометрический анализ проводили с использованием прибора FACScan (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния) с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны испускания 525 нм.Данные были собраны в режиме списка на 10 000 клеток после гейтирования для характерного прямого и ортогонального светорассеяния и низкой флуоресценции PI для исключения мертвых клеток. Среднюю интенсивность флуоресценции контрольных и испытуемых образцов определяли с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson).

Реактивы. Реагенты для культуры тканей были приобретены у Life Technologies, а MEM, использованный для корковых нейронов, был у Sigma (Сент-Луис, Миссури). Флуоресцентный краситель 2′, 7′ H 2 DCF-DA был получен от Molecular Probes (Eugene, OR).Все агонисты и антагонисты mGluR были получены от Tocris Cookston, а антисыворотки mGluR 1 и 2/3 были получены от Chemicon (Temecula, CA). Анти-mGluR5 было подарком от доктора Р. Геро (Институт Солка, Ла-Хойя, Калифорния). Остальные реагенты были от Sigma.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Антагонисты mGluR группы I усиливают токсичность глутамата

Если mGluR участвуют в токсичности нервных клеток, они могут играть либо защитную роль при токсичности глутамата, либо их активация может вызывать или усиливать токсичность.Чтобы изучить возможную роль mGluR в окислительной токсичности глутамата и других формах стресса, были изучены как краткосрочные первичные культуры коры, так и линия клеток гиппокампа мыши HT-22. В клетках НТ-22 отсутствуют ионотропные рецепторы глутамата (Maher and Davis, 1996), и они легко погибают под действием экзогенного глутамата окислительным путем (Davis and Maher, 1994; Li et al., 1997a,b; Maher and Davis, 1996; Tan et al. и др., 1998а,б). Кортикальные нейроны в культуре в течение <1 недели также лишены ионотропных рецепторов глутамата и погибают от глутамата через окислительный путь (Murphy and Baraban, 1990; Ratan et al., 1996). Поскольку глутамат сам по себе является токсичным агентом в этих экспериментах, необходимы антагонисты mGluR, чтобы различать потенциальную токсическую и защитную роль этих рецепторов. Предполагается, что в присутствии предельно токсичных уровней глутамата антагонисты mGluR будут усиливать токсичность глутамата, если активация mGluR глутаматом играет защитную роль, и уменьшать токсичность глутамата, если их активация усиливает токсичность. Рисунок 1 A показывает типичную зависимость доза-реакция между глутаматом и жизнеспособностью клеток.Полумаксимальная токсичность составляет ~1,5 мМ глутамата. Подобно глутамату, агонисты mGluR (±)-1-аминоциклопентан-транс-1,3, дикарбоновая кислота (ACPD) и квасквалат являются непосредственно токсичными для клеток, по крайней мере, частично благодаря ингибированию захвата цистина (см. ниже). Недавно идентифицированный агонист группы I, ( R , S )-3,5-дигидроксифенилглицин (DHPG), однако, нетоксичен. Чтобы определить, потенцируют ли антагонисты mGluR токсичность, и идентифицировать фармакологические свойства задействованных рецепторов, клетки предварительно инкубировали в течение 30 мин с различными антагонистами mGluR с последующим добавлением 1 мМ глутамата.Только в 1 мМ глутамата выживает около 90% клеток. На фигуре 1 B и в таблице 1 показано, что два антагониста фосфолипазы C связаны с активностью mGluR группы I, ( R , S )-1-аминоиндан-1,5-дикарбоновая кислота (AIDA) и dl-2-амино- 3-фосфонопропионовая кислота (АР-3) потенцирует токсичность при относительно низких концентрациях, тогда как для аналогичного эффекта требуются по меньшей мере в 10 раз более высокие концентрации антагонистов группы II и III. AP-3 является неконкурентным и, по-видимому, необратимым ингибитором опосредованного mGluR группы I гидролиза IP 3 (Schoepp et al., 1990), тогда как AIDA является мощным конкурентным антагонистом рецепторов группы I с предпочтением mGluR1 (Moroni et al., 1997).

Рис. 1. Агонисты и антагонисты mGluR

изменяют токсичность глутамата. Экспоненциально делящиеся клетки высевали в 96-луночные планшеты, как описано в разделе «Материалы и методы», и через 20 ч добавляли указанные реагенты. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ через 24 часа и подтверждали визуальным подсчетом. Все эксперименты были повторены не менее трех раз с одинаковыми результатами.Столбики погрешностей представляют собой среднее значение трех точек анализа ± стандартная ошибка среднего. A , HT-22: ACPD, ×–×; глутамат, •–•; ДГПГ, ○–○; квазиквалат, ▵–▵; U-73122, ▴–▴; АП-3, ■–■; и AIDA, ▪–▪. B , HT-22: AIDA, ×–×; АП-3, •–•; ДГПГ, ○–○; или U-73122 ▵–▵ добавляли к клеткам HT-22 через 20 часов после посева в указанных концентрациях. Глутамат добавляли через 30 минут при 1 мм к AIDA, U-73122 и AP-3 и при 1,5 мм к культурам, содержащим DHPG, и через 24 часа определяли жизнеспособность клеток с помощью анализа МТТ.Восемьдесят шесть процентов клеток выживали только в присутствии 1 мМ глутамата. Поскольку анализировалось потенцирование токсичности, данные были нанесены на график с 86% выживаемостью, нормализованной к 100% выживаемости, для сравнения с другими данными в тексте. В присутствии более высокой концентрации глутамата 1,5 мМ выживало только 51% клеток. Поскольку оценивалась защита с помощью DHPG, 51% нормализовали до нулевой (исходной) выживаемости, а максимальную защиту (51–100%) наносили на график как 100%. C , Кортикальные первичные культуры: через 2 дня после посева культуральную среду удаляли и заменяли свежей средой. К одному набору культур добавляли AP-3 или AIDA в разных концентрациях с последующим добавлением 2 мМ глутамата. Количество жизнеспособных клеток определяли через 24 часа с помощью анализа МТТ и подтверждали визуальным подсчетом. В отсутствие AIDA или АР-3 выживал 81% клеток. Гибель клеток потенцировалась как AIDA (×–×), так и AP-3 (•–•). Данные нормализованы до 81% выживаемости, что на рисунке представлено как 100%.В другом эксперименте клетки подвергались воздействию возрастающих концентраций DHPG (○–○), а затем 5 мМ глутамата. Только при 5 мМ глутамата выжило 47% клеток. Эти данные нормированы на 47% как 0% выживания.

Таблица 1.

Эффекты антагонистов mGluR

ДГФГ является агонистом mGluR группы I, эффективность которого в несколько раз выше, чем у глутамата (Ito et al., 1992; Schoepp et al., 1994; Conn and Pin, 1997). Поскольку ДГПГ нетоксичен в концентрациях до 1 мМ и активирует рецепторы группы I более эффективно, чем глутамат, должна быть возможность активировать защитный механизм против малотоксичной дозы глутамата путем предварительной инкубации с ДГПГ.Рисунок 1 B показывает, что DHPG действительно в ограниченной степени защищает клетки от токсичности низких доз глутамата. Активация mGluR группы I также защищает клетки от лишения цистина, формы окислительного стресса, который имитирует токсичность глутамата (см. рис. 5). Эти фармакологические данные свидетельствуют о том, что клетки HT-22 экспрессируют mGluRs группы I.

Чтобы определить, сходны ли фармакологические аспекты активации mGluR между клональной клеточной линией гиппокампа HT-22 и кортикальными нейронами, первичные культуры кортикальных нейронов крыс исследовали в отношении повышения токсичности глутамата с помощью AIDA и AP-3 и его ингибирование ДГПГ.На фигуре 1 C и в таблице 1 показано, что, как и в случае с клетками НТ-22, антагонисты mGluR группы I AIDA и АР-3 значительно усиливают минимально токсичные уровни глутамата. Напротив, агонист mGluR группы I DHPG защищает клетки от глутамата.

Клетки HT-22 экспрессируют mGluR1 и mGluR5

Приведенные выше эксперименты позволяют предположить, что клетки HT-22 экспрессируют mGluR функциональной группы I. Чтобы определить, действительно ли экспрессируются рецепторные белки, клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу с кроличьей антисывороткой к С-концевым пептидам mGluR1, 2, 3 и 5.Рисунок 2 A показывает, что клетки HT-22 экспрессируют как mGluR1 (, дорожка 2, ), так и mGluR5 (, дорожка 6, ), но не 2 или 3 (, дорожка 5, ). Линия клеток микроглии N9 не экспрессирует ни один из этих рецепторов и служит в качестве отрицательного контроля (дорожки 3 и 7 ). Положительным контролем для mGluR5 был белок, экспрессированный в ооцитах ( дорожка 8 ), тогда как положительным контролем для mGluRs 1 и 2/3 был лизат головного мозга мыши ( дорожки 1 и 4 ).mGluRs, экстрагированные из мозга, часто агрегируют и мигрируют на гелях SDS с более высокой молекулярной массой (Alaluf et al., 1995).

Рис. 2.

Стресс-индуцированные изменения экспрессии mGluR. Клоны , HT-22 или устойчивые к глутамату высевали на чашку 2 × 10 5 /60 мм и на следующий день подвергали лизису, пропускали через SDS-акриламидные гели при 10 мкг белка/дорожку и подвергали иммуноблотингу с указанной антисывороткой. Антисыворотки: , дорожки 1–3 , анти-mGluR1; дорожки 4 и 5 , анти-mGluR2/3; дорожки 6–8 , анти-mGluR5; дорожки 9–12 , анти-mGluR1; и дорожки 13–16 , анти-mGluR5.Лизаты: , дорожка 1, мозг мыши; пер.2 , НТ-22; переулок 3 , N9; дорожка 4 , мозг мыши; пер.5 , НТ-22; пер.6 , НТ-22; переулок 7 , N9; , дорожка 8 , mGluR5, экспрессируемая в ооцитах; дорожка 9 , НТ-22 дикого типа; пер. 10 , ХТ-22 р2; пер. 11 , ХТ-22 р9; пер.12 , НТ-22 р10; дорожка 13 , НТ-22 дикого типа; пер.14 , НТ-22 р2; пер.15 , НТ-22 р9; и пер.16 , НТ-22 р10.Иммуноблоты на дорожках 9 16 были разработаны в течение более короткого периода времени, чтобы подчеркнуть повышенные концентрации белка mGluR в резистентных клонах. Сканирование гелей привело к следующему относительному увеличению резистентных клеток. Анти-mGluR1: контроль, 1; г2 1,5 ± 0,01; г9, 12,1 ± 3,6; r10 и 24,4 ± 4,2. mGluR5: контроль, 1; г2, 5,7 ± 1,0; г9, 16,2 ± 2,4; р10, 70 ± 11,0; n = 4, B , клетки HT-22 (2 × 10 5 клеток/чашка 60 мм) или первичные нейроны коры (1 × 10 6 клеток/чашка 60 мм) высевали, как описано выше, и через 24 часа среду меняли на свободную от цистина или полную DMEM, содержащую 5 мМ глутамата.Клеточные лизаты готовили каждые 2 часа и подвергали иммуноблотингу с анти-mGluR1 или анти-mGluR5. I , -Cys, анти-mGluR1; II , +Glu, анти-mGluR1; III , -Cys, анти-mGluR5; и IV , +Glu, анти-mGluR5. Эксперимент был повторен трижды с аналогичными результатами.

Активация mGluR изменяет метаболизм глутатиона

Функциональной основой для инициирования окислительной токсичности глутамата является ингибирование поглощения цистина из среды глутаматом (Murphy et al., 1989). Поскольку агонисты и антагонисты mGluR являются структурными аналогами глутамата, возможно, что они изменяют токсичность глутамата, напрямую изменяя скорость поглощения цистина. Рисунок 3 показывает, что два наиболее широко используемых агониста mGluR, ACPD и quisqualate, сильно ингибируют поглощение цистина. Кисквалат (ID 50 , 40 мкм) немного более эффективен, чем глутамат (ID 50 , 80 мкм), тогда как ACPD менее эффективен (ID 50 , 600 мкм). Агонист mGluR группы I DHPG и антагонист AIDA также ингибируют поглощение цистина в высоких концентрациях (ID 50 , 1.2 мм), тогда как антагонист II группы 2 S -этилглутамат (EGLU) и антагонист I группы AP-3 неэффективны. Поэтому нельзя предположить, что mGluR являются единственной мишенью в нервной системе для этих аналогов глутамата.

Рис. 3.

Влияние агонистов и антагонистов mGluR на поглощение цистина. Клетки HT-22 промывали предварительно нагретым HBSS и инкубировали с 70 мкл-[ 35 S]цистина с реагентами или без них в указанных концентрациях. Поглощение прекращали промыванием холодным HBSS, клетки солюбилизировали и определяли изотоп.Данные представлены как средний процент контроля поглощения в отсутствие препаратов. АИДА, ○–○; ДХПГ, ▵–▵; АКПД, ■–■; квазиквалат, ▿–▿; глутамат, •–•; ЭГЛУ, ▴–▴; и АР-3, ▪–▪. Данные трехкратного определения представлены со средним значением ± стандартная ошибка. Эксперимент был повторен дважды с неразличимыми результатами.

Поскольку AIDA или AP-3 и DHPG оказывают противоположное влияние на токсичность глутамата (рис. 1 B , C ), возможно, что они оказывают противоположное влияние на поглощение цистина в присутствии минимально токсичного 1 мМ глутамата. .Чтобы формально исключить такую ​​возможность, клетки инкубировали в 1 мМ глутамата с полумаксимальными эффективными концентрациями AIDA, AP-3 или DHPG. EGLU был включен в качестве отрицательного контроля. На рис. 4 A показано незначительное влияние AIDA на поглощение цистина при концентрациях, при которых происходит резкое усиление токсичности (рис. 1 B , C ). DHPG и AP-3 также неактивны. Эти результаты показывают, что эффекты AIDA, DHPG и AP-3 на токсичность глутамата не вызваны их изменением начальной скорости поглощения цистина.

Рис. 4.

Влияние агонистов и антагонистов mGluR на поглощение цистина, глутатиона и активных форм кислорода. A , Начальные скорости поглощения цистина измеряли в присутствии или в отсутствие указанных реагентов и в присутствии или в отсутствие 1 мМ глутамата (AIDA, 100 мкм; AP-3, 500 мкм; или EGLU, 500 мкм) или 1,5 мМ глутамат (DPHG, 600 мкм). Цельные батончики , Без глутамата; полосатые бруски , +Glu. Поглощение цистина контрольным образцом составило 17 063 ± 831 имп/мин/мг белка, что было принято за 100%, и соответственно были получены другие значения. B , клетки НТ-22 обрабатывали указанными реагентами в течение 12 часов и измеряли уровни глутатиона, как описано в разделе «Материалы и методы». Контрольное значение (80,2 ± 4,8 нмоль GSH/мг белка) принимали за 100 %, соответственно выражали остальное. C , Уровни активных форм кислорода измеряли в клетках HT-22, обработанных аналогично B в присутствии H 2 DCF-DA, и сообщали о средних каналах интенсивности флуоресценции дихлорфлуоресцеина ( DCF ). .* Достоверно отличается от контроля ( p ≤ 0,001). Опыты повторяли не менее двух раз с аналогичными результатами.

Ингибирование поглощения цистина глутаматом вызывает потерю клеточного GSH (Murphy et al., 1989) с последующим накоплением ROS (Tan et al., 1998b). Чтобы понять, где в этом пути активация mGluRs изменяет токсичность глутамата, было исследовано влияние агониста mGluR DHPG и антагониста AIDA на эти параметры. Клетки НТ-22 обрабатывали 1 мМ глутаматом в присутствии или в отсутствие лигандов mGluR в течение 12 часов, собирали и определяли клеточный GSH.GSH снижается до ~20% от контрольного значения в присутствии 1 мМ глутамата (рис. 4 B ), и клетки не погибают (рис. 1 A ). Напротив, клетки, обработанные DHPG, сохраняют 50% контрольного уровня GSH в этих условиях, тогда как клетки, обработанные AIDA, имеют ~8% контрольного уровня (рис. 4 B ), и клетки погибают (рис. 1 ). В ). Затем клетки обрабатывали глутаматом вместе с лигандами mGluR группы I и определяли степень накопления АФК с помощью диацетата дихлордигидрофлуоресцеина.Этот проникающий через мембрану нефлуоресцентный краситель становится флуоресцентным при деэтерификации и реакции с АФК в цитоплазме (Bass et al., 1983). Ранее было показано, что потеря GSH до 85% от контрольного уровня вызывает лишь 5-10-кратное повышение уровня АФК (Tan et al., 1998b). Однако большая потеря GSH приводит к увеличению АФК в несколько сотен раз, что приводит к гибели клеток (Tan et al., 1998b). В присутствии 1 мМ глутамата контрольные клетки и клетки, обработанные DHPG, имеют одинаковые уровни АФК, но клетки, обработанные AIDA, накапливают в 10 раз больше АФК (рис.4 С ). Из приведенных выше данных можно сделать вывод, что активация mGluR уменьшает потерю клеточного GSH. Антагонисты mGluR нарушают этот защитный механизм, что приводит к накоплению избытка АФК и, в конечном счете, к гибели клеток в присутствии нетоксичных уровней глутамата.

Агонисты mGluR защищают от других форм нейрональной токсичности

Если окислительная токсичность глутамата приводит к стрессу, опосредованному свободными радикалами, то агонисты mGluR группы I должны защищать клетки от других форм вызванной стрессом гибели клеток.Возможно, наименее сложная форма окислительного стресса вызывается истощением цистина из питательной среды (Yonezawa et al., 1996). Истощение цистина приводит к уменьшению GSH, продукции перекиси и гибели клеток. В этих условиях можно было бы предсказать, что низкие, нетоксичные уровни агонистов mGluR будут защищать клетки, тогда как антагонисты mGluR ничего не сделают. Фигура 5 A показывает, что агонист группы I DHPG действительно защищает клетки. Антагонист группы I AIDA не имеет эффекта (данные не показаны).Подобно лишению цистина, глюкозное голодание (гипогликемия) приводит к гибели клеток, которая включает истощение GSH и продукцию активных форм кислорода (Ikeda et al., 1994; Papadopoulos et al., 1997). Поэтому возник вопрос, защищает ли активация mGluR группы I клетки от гипогликемии. НТ-22 и первичные культуры коры высевали в микротитровальные чашки и через 2 дня снижали концентрацию глюкозы в среде с 25 до 0,5 мМ. Добавляли агонист mGluR DHPG и через 24 часа определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ и визуального подсчета.Рисунок 5 A показывает, что DHPG защищает как первичные, так и HT-22 нейроны от голодания по глюкозе. Как и в случае цистинового голодания, депривация глюкозы не усиливается антагонистами группы I (данные не показаны).

Рис. 5.

ДГФГ блокирует гибель клеток из-за цистинового или глюкозного голодания и снижает чувствительность клеток к глутамату. A , HT-22 или первичные клетки коры помещали в культуральную среду, содержащую 2% нормального количества цистина, с последующим увеличением количества DHPG. В отсутствие DHPG выжило 72% клеток HT-22 (■–■), как и 57% первичных нейронов коры (▵–▵).Для сравнения данные нормированы на 72 или 57% как 100% токсичность (см. легенду к рис. 1). В другом эксперименте клетки заменяли на 0,5 мМ глюкозную среду и добавляли увеличивающиеся количества DHPG. В этих условиях выжило 0% клеток HT-22 (○–○) и 40% первичных клеток коры (×–×). Данные нормированы, как указано выше. Данные представляют собой среднее значение трехкратных определений ± стандартная ошибка среднего. Эксперименты проводились не менее трех раз. B , Экспоненциально делящиеся клетки HT-22 высевали в 96-луночные планшеты для микротитрования по 2×10 3 клеток на лунку.Через двадцать четыре часа добавляли 100 мкМ глутамата или ACPD на период 2 часа. Затем планшеты промывали и добавляли свежую среду. Увеличивающиеся количества глутамата или ACPD добавляли как в лунки, предварительно инкубированные с глутаматом (×–×) или ACPD (▵–▵), так и глутамат (•–•) или ACPD (○–○) также добавляли в культуры, ранее не подвергавшиеся воздействию глутамат или ACPD. Данные нормализованы до 100% для 100 мкМ глутамата и 100 мкМ ACPD, что дает выживаемость 92 и 89% соответственно (рис. 1). Данные представляют собой среднее значение трехкратных определений ± стандартная ошибка среднего.Опыты повторялись не менее четырех раз с аналогичными результатами.

Активация mGluR коррелирует с IP

3  аккумуляция

Характерной чертой, которая отличает mGluR группы I от других классов mGluR, является то, что они связаны с путем фосфолипазы C. Напротив, активация рецепторов группы II и III приводит к снижению уровня цАМФ (Nakanishi, 1994). Поэтому накопление массы IP 3 измеряли в ответ на глутамат и агонисты mGluR.Кроме того, анализировали реакцию цАМФ. Таблица 2 показывает, что глутамат и агонист mGluR группы I DHPG стимулируют накопление фосфоинозитида, тогда как уровни цАМФ не изменились. Антагонист группы I AIDA значительно снижает накопление IP 3 , стимулированное глутаматом. Ингибитор фосфолипазы С и А 2 U-73122 ингибирует активацию фосфолипазы С (таблица 2; Bleasdale et al., 1990). В полумаксимальной концентрации 2,5 мкМ U-73122 ингибирует накопление IP 3 , индуцированное ДГПГ (табл. 2), и потенцирует токсичность 1 мМ глутамата (рис.1 В ). Эти данные подтверждают данные об антагонистах и ​​агонистах и ​​указывают на то, что IP 3-связанные метаботропные рецепторы группы I активируются глутаматом в клетках НТ-22.

Таблица 2.

Модуляция IP 3 и цАМФ глутаматом

Экспрессия mGluR изменяется под действием окислительного стресса

Если экспрессия и активация mGluR группы I оказывает защитное действие против токсичности глутамата, их синтез активируется при воздействии глутамата и других форм окислительного стресса.Кроме того, клетки, отобранные по устойчивости к глутамату, могут иметь более высокие уровни рецептора. Чтобы определить, активируются ли mGluRs глутаматом, клетки HT-22 подвергали воздействию 5 мМ глутамата в течение различных периодов времени, а клеточные лизаты помещали в SDS-акриламидные гели и блоттировали антисыворотками против mGluR1, 5 или 2/3. В любой момент времени не было обнаружено белка mGluR 2/3, но на рисунке 2 B показано, что имело место усиление активности mGluR5 ( III ), но не белка mGluR1 ( II ).Полный курс количественно оценивается в таблице 3. Хотя клетки HT-22 чувствительны к кратковременному воздействию глутамата, были отобраны и охарактеризованы клетки, которые не погибают от 10 мМ глутамата (Sagara et al., 1998). Когда клеточные лизаты из этих устойчивых клеток были блотированы антисывороткой к mGluR, наблюдалось 70-кратное увеличение экспрессии mGluR1 и 24-кратное увеличение mGluR5 (рис. 2 A , дорожки 9 16). ).

Таблица 3.

Окислительный стресс индуцирует метаботропные рецепторы глутамата

Чтобы определить, реагируют ли кортикальные нейроны аналогично клеткам HT-22, первичные культуры подвергали воздействию глутамата, а синтез mGluR 1 и 5 отслеживали в зависимости от времени методом вестерн-блоттинга.На фигуре 2 B показано, что, в отличие от HT-22, культивируемые нейроны коры головного мозга реагируют на глутамат повышением экспрессии mGluR1 ( II ), тогда как экспрессия mGluR5 не изменяется воспроизводимо ( IV ). Количественные данные в табл. 3 показывают, что уровень индуцированной экспрессии mGluR5 в первичных культурах подобен уровню mGluR1 в клетках НТ-22.

Экспрессия mGluR может усиливаться за счет прямого взаимодействия глутамата с его рецептором или в результате окислительного стресса, вызванного глутаматом.Чтобы различить эти альтернативы, клетки подвергали воздействию среды, обедненной цистином, состояние, которое приводит к форме окислительного стресса, сходной с токсичностью окислительного глутамата (Yonezawa et al., 1996). Экспрессию mGluR1 и mGluR5 затем отслеживали каждые 2 часа с помощью вестерн-блоттинга. На фигуре 5 B показано, что, как и в случае токсичности глутамата, mGluR5 активируется в клетках HT-22 ( III ), а mGluR1 активируется в первичных нейронах коры ( I ). Эти данные количественно представлены в таблице 3.

Защита от токсичности глутамата быстро десенсибилизируется

mGluR могут быстро десенсибилизироваться при воздействии низких концентраций глутамата, поскольку в первичных культурах коры реакция IP 3 теряется после 1-часового воздействия 100 мкм глутамата (Catania и др., 1991). Чтобы определить, теряется ли защитный эффект активации mGluR при воздействии глутамата, клетки HT-22 подвергались воздействию 100 мкМ глутамата или 100 мкМ концентрации агониста группы I и II ACPD в течение различных периодов времени, агонист вымывался и затем клетки постоянно подвергались воздействию возрастающих концентраций глутамата.Жизнеспособность клеток определяли через 20 часов. Время полумаксимальной десенсибилизации к воздействию глутамата составляло 45 минут, а через 2 часа клетки, предварительно инкубированные с глутаматом, были гораздо более чувствительны к глутамату, чем клетки, подвергнутые непосредственному воздействию глутамата (рис. 5 B ). Это связано с потерей защитного эффекта активации mGluR и аналогично эффектам антагонистов mGluR AIDA и AP-3. Если эта десенсибилизация работает через инозитоловый путь, как описано Catania et al., (1991), то предварительное воздействие глутамата на клетки должно блокировать последующее увеличение IP 3 при воздействии глутамата. Таблица 2 показывает, что клетки, предварительно подвергнутые воздействию 100 мкМ глутамата в течение 2 часов, больше не реагируют на 1 мМ глутамата с увеличением массы IP 3 .

ОБСУЖДЕНИЕ

Приведенные выше данные показывают, что активация метаботропных рецепторов глутамата группы I вызывает клеточный ответ, защищающий от токсичности окислительного глутамата, дефицита цистина и гипогликемии.Этот вывод основан на наблюдениях, что агонисты mGluR группы I защищают клетки и стимулируют накопление IP 3 . Напротив, антагонисты группы I усиливают токсичность глутамата. Наконец, воздействие глутамата на клетки как снижает защитный ответ (десенсибилизация), так и увеличивает накопление mGluR1 в нейронах коры и клетках mGluR5 HT-22. Эти результаты расширяют известные функции mGluRs группы I в ЦНС, включая роль в защите от нескольких форм окислительного стресса.

mGluRs и токсичность нервных клеток

Был проведен ряд очевидно противоречивых исследований, в которых изучалась роль mGluRs в различных формах нейротоксичности. Однако все эти исследования проводились с гетерогенными популяциями клеток, и в некоторых случаях использовались очень высокие дозы агонистов mGluR, которые могут непосредственно убивать клетки путем окислительной глутаматной токсичности (рис. 1, , A , 3). . Прямая инъекция агониста группы I ACPD в гиппокамп (Sacaan and Schoepp, 1992) или системное введение ACPD (McDonald et al., 1993) вызывает судороги и гибель клеток. Эти эффекты не блокировались антагонистами NMDA, которые часто защищают клетки от эксайтотоксичности глутамата. Также утверждалось, что активация mGluR1 способствует индуцированной травмой гибели клеток (Mukhin et al., 1996). В соответствии с данными in vivo , некоторые исследования с культивируемыми клетками показали, что активация mGluRs группы I потенцирует эксайтотоксичность, опосредованную рецептором NMDA, предположительно потому, что эти рецепторы опосредуют увеличение IP 3 , что приводит к дополнительному Ca . 2+ в клетках, что синергично с NMDA-зависимым притоком Ca 2+ (Bruno et al., 1995б). Однако другие группы показали, что активация рецепторов группы I защищает от эксайтотоксичности (Pizzi et al., 1993), повышает выживаемость культивируемых клеток Пуркинье (Mount et al., 1993) и что антагонисты группы I вызывают дегенерацию сетчатки у развивающихся грызунов (Price et al., 1995). В отличие от противоречивых сообщений о mGluR группы I, общепризнано, что активация цАМФ-связанных рецепторов группы II приводит к защите от эксайтотоксичности и других повреждений нейронов (Buisson and Choi, 1995; Nicoletti et al., 1996).

В клетках НТ-22 отсутствуют ионотропные глутаматные рецепторы (Maher and Davis, 1996) и не экспрессируются mGluR группы II (рис. 2 A ). Поэтому изучение роли рецепторов группы I в защите от токсических состояний менее неоднозначно, чем при работе со смешанными популяциями нервных клеток. Приведенные выше данные показывают, что активация рецептора mGluR1 группы I приводит к защите клеток от ряда токсических воздействий. Этот эффект, по-видимому, опосредуется связыванием рецептора с гидролизом PI, поскольку агонисты рецепторов защитной группы I стимулируют накопление IP 3 , тогда как антагонисты рецепторов группы I, которые блокируют накопление IP 3 , усиливают токсичность глутамата (таблица 2).Эти данные согласуются с наблюдениями о том, что активация PKC защищает клетки HT-22 от окислительной глутаматной токсичности (Davis and Maher, 1994), поскольку обмен PI приводит к повышению уровня диацилглицерола, который, в свою очередь, активирует PKC.

Механизм защиты

Одним из начальных явлений окислительной токсичности глутамата и других форм окислительного стресса является быстрое снижение внутриклеточного GSH (Murphy et al., 1989). Это приводит к ряду последующих событий, включая активацию липоксигеназы, образование перекиси и массивный приток кальция через каналы, регулируемые цГМФ, непосредственно перед лизисом клеток (Li et al., 1997а,б). Данные на рисунке 4 показывают, что, хотя агонисты или антагонисты mGluR группы I не изменяют поглощение цистина, они оказывают значительное влияние на уровни GSH. Агонисты увеличивают GSH по сравнению с одним глутаматом, тогда как антагонисты уменьшают GSH. Степень этой модификации GSH достаточна, чтобы либо ингибировать, либо инициировать все последующие события, ведущие к гибели клеток (Tan et al., 1998b). Хотя точный механизм, с помощью которого активация mGluR влияет на метаболизм GSH, еще предстоит определить, существует несколько альтернатив.Активация mGluR группы I может влиять на экспрессию или активность белков, необходимых для поддержания клеточного GSH в стрессовых условиях. Например, экспрессия ограничивающего скорость синтетического фермента GSH γ-глутамилцистеинсинтетазы (γ-GCS) может усиливаться различными стимулами (Morales et al., 1997; Mulcahy et al., 1997; Sekhar et al., 1997). . Кроме того, активность фермента γ-GCS может повышаться посттрансляционно (Ochi, 1995, 1996). Экспрессия генов и ферментативная активность этих белков также могут модулироваться временным увеличением Ca 2+ (Bading et al., 1997), поскольку активация mGluR группы I увеличивает внутриклеточный IP 3 (таблица 2), а IP 3 запускает высвобождение Ca 2+ из ER через рецепторы IP 3 (Dowson, 1997). Наконец, вместо непосредственной модуляции синтеза GSH активация mGluR группы I может снижать потребление GSH, например, за счет уменьшения продукции АФК из митохондрий. Эти альтернативы в настоящее время изучаются.

Глутамат приводит к десенсибилизации mGluR

Десенсибилизация определяется как тенденция к снижению реакции рецептора со временем после воздействия агониста.Клетки HT-22 десенсибилизированы в отношении способности глутамата убивать клетки при предшествующем воздействии глутамата. Первичные культуры зернистых клеток мозжечка также десенсибилизированы глутаматом, когда гидролиз полифосфоинозитида измеряется после повторного воздействия глутамата (Catania et al., 1991), вероятно, за счет PKC-зависимого фосфорилирования рецептора (Alaluf et al., 1995; Gereau и Хайнеманн, 1998). Аналогичное наблюдение было сделано с клетками НТ-22 (табл. 2). Поскольку одной из функций mGluRs, по-видимому, является защита клеток от токсического воздействия, любопытно, что развился механизм, достаточно быстро прекращающий этот ответ.Десенсибилизация может быть необходима для восстановления функции общих нижестоящих рецепторных путей, необходимых для поддержания жизнеспособности и нормальной физиологии. Например, большая группа рецепторов клеточной поверхности связана с оборотом IP 3 , и как десенсибилизация, так и передача сигналов могут взаимно влиять на различные точки путей передачи сигнала, в зависимости от конкретного рецептора (Wojcikiewicz et al., 1993; Фишер, 1995). В качестве альтернативы, начального воздействия глутамата может быть достаточно, чтобы вызвать изменения в экспрессии генов, которые приводят к дополнительной защите, потому что клетки могут стать устойчивыми к глутамату за счет усиления антиоксидантных ферментов и ферментов, участвующих в метаболизме глутатиона (Sagara et al., 1998). Устойчивые к глутамату клетки также усиливают экспрессию mGluR5 до 70 раз (Fig. 2 A ).

Глутамат и другие формы стресса усиливают накопление mGluR

Воздействие на клетки HT-22 глутамата или окислительного стресса, вызванного лишением цистина, увеличивает скорость накопления mGluR5, как определено вестерн-блоттингом; Белок mGluR1 не изменен. Напротив, концентрация mGluR1 увеличивается при тех же условиях в первичных культурах коры, тогда как экспрессия mGluR5 не изменяется.Следовательно, существуют разные механизмы связи между путями передачи сигнала стресса и подтипами mGluR в нейронах коры и клетках HT-22. Однако эти данные показывают, что реакция на стресс аналогична и согласуется с результатами in vivo , которые показывают, что mGluR группы I активируются в гиппокампе после транзиторной глобальной ишемии (Chen et al., 1988; Seren et al., 1989). Экспрессия mGluR5 также модифицируется белковыми факторами роста в культивируемых кортикальных астроцитах.Основной фактор роста фибробластов и эпидермальный фактор роста усиливают экспрессию mGluR5 (Miller et al., 1995), тогда как тромбин подавляет экспрессию mGluR5 (Miller et al., 1996). Если передача сигналов IP 3 участвует в защите клеток от повреждения или гибели, то повышенная экспрессия mGluRs группы I может сделать клетки более чувствительными к глутамату или обеспечить более высокий базальный уровень IP 3 .

Заключение

Наконец, необходимо спросить, каково функциональное значение явно кратковременного защитного ответа, вызванного активацией mGluRs группы I? Глутамат является наиболее распространенным нейротрансмиттером в ЦНС млекопитающих с внутриклеточной концентрацией, приближающейся к нескольким миллимолям (Coyle and Puttfarcken, 1993).Поскольку повышенное воздействие глутамата может быть токсичным для нейронов как посредством рецептор-опосредованного, так и окислительного пути токсичности глутамата, и поскольку временный избыток глутамата может быть частым явлением в областях, насыщенных глутаминергическими терминалями, кратковременная активация mGluRs группы I может быть необходим для предотвращения повреждения нервных клеток и синапсов. Поскольку активация mGluR группы II также является защитной (Nicoletti et al., 1996), комбинированный эффект этих двух наиболее распространенных в ЦНС mGluR может привести к мощному защитному ответу на избыток глутамата.Этот механизм также может быть задействован при незначительной травме, при которой происходит минимальное клеточное повреждение, и он может ликвидировать разрыв между временем первоначального повреждения и индукцией более долговременного стрессового ответа, опосредованного транскрипцией.

Footnotes

  • Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01 NS09658 и PO1 NS-28121 для DS и постдокторской стипендией для Y.S. (2Ф32НС 10032). Мы благодарим докторов. P. Maher, H. Kimura и Y. Liu за критическое прочтение этой рукописи, Dr.D. Chambers за помощь в анализе сортировки клеток с помощью флуоресценции и Dr. R. Gereau за ооцит, экспрессирующий mGluR5.

    Корреспонденцию следует направлять Дэвиду Р. Шуберту, Институт биологических исследований Солка, Ла-Хойя, Калифорния 92037.

Список продуктов по торговым маркам ApexBio

Мы используем файлы cookie на нашем веб-сайте, чтобы предоставить вам наиболее актуальный опыт, запоминая ваши предпочтения и повторяя посещения. Нажимая «Принять все», вы соглашаетесь на использование ВСЕХ файлов cookie.Однако вы можете посетить «Настройки файлов cookie», чтобы предоставить контролируемое согласие.

Требуемые файлы cookie

Активен всегда

Эти файлы cookie строго необходимы для работы сайта, вы можете отключить их, изменив настройки вашего браузера, но вы не сможете нормально пользоваться сайтом.

Используемые файлы cookie

Функциональные файлы cookie

Эти файлы cookie предоставляют необходимую информацию приложениям самого веб-сайта или интегрированным третьим лицам, если вы отключите их, вы можете столкнуться с некоторыми проблемами в работе страницы.

Используемые файлы cookie

Куки производительности

Эти файлы cookie используются для анализа трафика и поведения клиентов на сайте, помогают нам понять и понять, как вы взаимодействуете с сайтом, чтобы повысить производительность.

Используемые файлы cookie

Управляемые файлы cookie

Эти файлы cookie могут быть от самого сайта или от третьих лиц, они помогают нам создать профиль ваших интересов и предлагать вам рекламу, ориентированную на ваши предпочтения и интересы.

Используемые файлы cookie

Пользователю сообщается, что у него есть возможность настроить свой браузер таким образом, чтобы он был проинформирован о получении файлов cookie, имея возможность, если он того пожелает, предотвратить их установку на свой жесткий диск.

Ниже мы приводим ссылки различных браузеров, через которые можно сделать такую ​​настройку:

Firefox отсюда: http://support.mozilla.org/es/kb/habilitar-y-deshabilitar-cookies-que-los-sitios-web

Chrome отсюда: https://support.google.com/chrome/answer/95647?hl=es

Проводник отсюда: https://support.microsoft.com/es-es/help/17442/windows-internet-explorer-delete-manage-cookies

Safari отсюда: http://support.apple.com/kb/ph5042

Опера отсюда: http://help.opera.com/Windows/11.50/es-ES/cookies.html

Международный союз фундаментальной и клинической фармакологии. CXI. Фармакология, передача сигналов и физиология метаботропных глутаматных рецепторов

9102 Группа I и агонист AMPA
l-глутамат Эндогенный агонист rR1: 6.5; 6,4; чR2: 5,1; HR7: 3.2 Основным возбуждающим нейротрансмиттером 1
несущественный
(1S, 3R) -AcPD (1 S , 3 R ) -1-аминоциклопентан-1,3-DicarboxyLic кислота Агонисты группы I и II rR1: 5,5; rR5: 5,7 Нейротоксичность; антипаркинсонический; Память 2
ACPT-II
(1 R , 3 R , 4 S ) -1-аминоциклопентан-1,3,4-трикарбоновой кислоты антагонист Pan-MGLU рР1а: 3.9 ; rR2: 4,1 ; RR4A: 4.1 3 3
CPPG
CPPG
(RS) — α -Cyclopropyl-4-фосфонофенилглицин Группа II / III антагонист RR2: 8,7 ; rR3: 7,3 ; rR4: 4,9 ; rR6: 5,4 , rR7: 4,8 ; RR8: 4,9 4 4
( S ) -MCPG ( S ) — α -метил-4-карбоксифенилглицин неселективной антагонист MGLU RR1: 3.8; rR5: 3,7 Пространственное обучение; антипсихотический 5
LY341495 (2S)-2-амино-2-[(1S,2S)-2-карбоксициклопроп-1-ил]-3-(ксант-9-ил) пропановая кислота Антагонист группы II, но блокирует все подтипы hR1: 5.2 ; чR2: 8,6-7,6; чR3: 8,4; чR4: 4,7 ; чR5: 5,1 ; чR7: 6,7-6,5; rR7: 6,3; hR8:7.2 Антидепрессант; объем памяти; гипноз; Вывод 6
Group I MGLU рецепторы
AIDA ( RS ) -1-Aminoindan-1,5-Dicarboxylog Cys группа I антагонист RR1: 4.4-4,0; rR5: 4,3 Эпилепсия; пространственная память; боль; нейропротекция 7
(R,S)-CHPG (RS)-2-хлор-5-гидроксифенилглицин mGlu 5 агонист rR1: 3,8; rR5: 3,4 Нейропротекция; боль; эпилепсия 8
(S)-3,5-DHPG (S)-3,5-дигидроксифенилглицин Агонисты группы I объем памяти; боль; EPILEPSY 9
LY367385 ( S

0

( S

0

( S ) — (+) — α -Amino-4-Carboxy-2-метилбенцененцесусная кислота MGLU 1 Антагонист RR1: 5.1 ; rR5: <4 Нейропротекция; антидепрессант 10
L-кваскваловая кислота (L)-(+)- α -амино-3,5-диоксо-1,2,4-оксадиазолидин-2-пропановая кислота rR1: 7,5 Эпилепсия; нейротоксичность 11
Группа II mGlu-рецепторы
DCG-IV (2S,2′R,3′R)-2-(2′,3′-дикарбоксициклопропил)глицин группа II 0 чR2: 7.2-6,4; hR3: 7,9 Нейролептик; нейропротекция; противосудорожное средство 12
LY2812223 (MP-101, пролекарство: LY2979165) аммоний (1R,2S,4R,5R,6R)-4-((4H-1,2,4-триазол-3-ил )тио)-2-((S)-2-аминопропанамидо)-2-карбоксибицикло[3.1.0]гексан-6-карбоксилата гидрат mGlu 2 агонист hR2: 8.1 Нейролептик; клинические испытания биполярного расстройства (фаза 1) и психоза, связанного с деменцией, и/или ажитации и агрессии (фаза 2)1,0]гексан-2,6-дикарбоновая кислота mGlu 2/3 агонист rR2 8,3 rR3: 7,6 Анксиолитик; вывод; антипаркинсонический; антипсихотическое средство; анксиолитик 14
LY379268 (1R,4R,5S,6R)-4-амино-2-оксабицикло[3.1.0]гексан-4,6-дикарбоновая кислота чR2: 9,1 -8,6; hR3: 8,9 -8,2 Анксиолитик; антидепрессант; антипсихотическое средство; нейропротекция 15
LY541850 (1S,2S,4R,5R,6S)-2-амино-4-метилбицикло[3.1,0]гексан-2,6-дикарбоновая кислота mGlu 2 агонист, mGlu 3 антагонист hR2: 7,0; hR3: <5 Антипсихотическое действие 16
Помаглуметад (LY404039) 2/3 агонист rR2: 7.6 rR3: 7.3 Алкоголизм; антипсихотическое средство; анксиолитик; клинические испытания пролекарств: LY2140023 при психозах (фаза II) и посттравматическом стрессовом расстройстве (III) -1,2,4-трикарбоновая кислота Агонист группы III rR4: 5.5 ; rR6: 5 ; rR7: 3,6 ; rR8: 5.3 Нейропротекторный; анксиолитик; антидепрессант; Analgesic 18
Cinnabarinic Cyct 2-Amino-3-Oxo-3 H -Chenoxazine-1,9-дикарбоновой кислоты MGLU 4 частичный агонист RR4A < 4 Нейропротекция, нецелевые эффекты у мышей с нокаутом mGlu 4 19
L-AP4 L-(+)-2-амино-4-фосфономасляная кислота Агонист группы III 7; Р6: 6,1; rR7: 3,7; R8: 6.1 Нейропротекция, анальгетика, анти-паркинсонский 20
20
L-ThioAP4 L — (+) — 2-амино-4-тиофосфонобутическая кислота группа III агонист RR4: 7.4 ; rR6: 6,1 ; rR7: 3,7 ; rR8: 7.3 21
L-SOP O-фосфо-L-серин Эндогенный агонист группы III; Антагонист II группы rR4: 7.4 ; rR6: 6,1 ; rR7: 3,7 ; rR8: 7.3 Нейропротекция; антипаркинсонический; анксиолитик; противоэпилептический 22
LSP1-2111 (2S)-2-амино-4-{гидрокси[гидрокси(4-гидрокси-3-метокси-5-нитрофенил)метил]фосфорил}бутановая кислота Группа III агонист rR4: 6; рР6 5,5; рR7: 4; rR8: 4,7 Антипаркинсонический; антипсихотическое средство; анксиолитик 23
LSP2-9166 (2S)-2-амино-4-(((4-(карбоксиметокси)фенил) (гидрокси)метил) (гидрокси)фосфорил)бутановая кислота mGlu 4 /7 агонист rR4: 7.2; rR7: 5,7; rR8: 4,3 Эпилепсия; потребление этанола и рецидив; эффект морфина 24
LSP4-2022 (2S)-2-амино-4-({[4-(карбоксиметокси)фенил](гидрокси)метил}(гидрокси)фосфорил)бутановая кислота mGlu4 агонист rR4: 7 ; rR6: 5,4 ; rR7: 4,9 ; rR8: 4,5 Анальгетик; антидепрессант; нейролептики

Навигация по записям

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.